A molekuláris biológiai alapfogalmak magyarázata
1. cDNS és cccDNS: A cDNS egy kétszálú DNS, amelyet reverz transzkriptáz mRNS-ből szintetizál;A cccDNS egy plazmid, kétszálú zárt körkörös DNS, amely mentes a kromoszómától.
2. Szabványos hajtogatási egység: a fehérje másodlagos szerkezeti egysége, az α-hélix és a β-lemez speciális geometriai elrendeződésű szerkezeti blokkokat képezhet különféle összekötő polipeptideken keresztül.Az ilyen határozott hajtogatást általában szuperszekunder szerkezetnek nevezik.Szinte minden harmadlagos szerkezet leírható ezekkel a hajtogatási típusokkal, sőt ezek kombinált típusaival is, ezért ezeket szabványos összecsukható egységeknek is nevezik.
3. CAP: ciklikus adenozin-monofoszfát (cAMP) receptor fehérje CRP (cAMP receptor protein), a cAMP és CRP kombinációja után létrejövő komplexet aktiváló fehérje CAP-nak (cAMP activated protein) nevezzük.
4. Palindrom szekvencia: Egy DNS-fragmens egy szegmensének fordított komplementer szekvenciája, gyakran egy restrikciós enzimhely.
5. micRNS: Komplementer interferáló RNS vagy antiszensz RNS, amely komplementer az mRNS szekvenciával és gátolhatja az mRNS transzlációját.
6. Ribozim: katalitikus aktivitású RNS, amely autokatalitikus szerepet játszik az RNS splicing folyamatában.
7. Motívum: A fehérjemolekulák térszerkezetében van néhány hasonló háromdimenziós formájú és topológiájú lokális régió
8. Jelpeptid: a fehérjeszintézis során az N-terminálison 15-36 aminosavból álló peptid, amely a fehérje transzmembránját irányítja.
9. Attenuátor: Egy operátorrégió és egy strukturális gén közötti nukleotidszekvencia, amely leállítja a transzkripciót.
10. Varázsfolt: Amikor a baktériumok növekednek, és az aminosavak teljes hiányával találkoznak, a baktériumok vészhelyzeti reakciót váltanak ki, hogy leállítsák az összes gén expresszióját.A vészhelyzeti választ generáló jelek a guanozin-tetrafoszfát (ppGpp) és a guanozin-pentafoszfát (pppGpp).A PpGpp és a pppGpp szerepe nem csak egy vagy néhány operon, hanem ezek nagy részét érinti, ezért szuperregulátoroknak vagy mágikus foltoknak nevezik őket.
11. Upstream promoter elem: a promoter aktivitásában szabályozó szerepet játszó DNS-szekvenciára utal, mint például a TATA a -10 régióban, a TGACA a -35 régióban, fokozók és attenuátorok.
12. DNS próba: ismert szekvenciájú DNS jelölt szegmense, amelyet széles körben használnak ismeretlen szekvenciák kimutatására és célgének szűrésére.
13. SD szekvencia: A riboszóma és az mRNS kötőszekvenciája, amely szabályozza a transzlációt.
14. Monoklonális antitest: olyan ellenanyag, amely csak egyetlen antigéndetermináns ellen hat.
15. Kozmid: Ez egy mesterségesen megszerkesztett exogén DNS-vektor, amely a fág mindkét végén megtartja a COS régiókat, és kapcsolódik a plazmidhoz.
16. Kék-fehér foltos szűrés: LacZ gén (β-galaktozidázt kódol), az enzim képes lebontani az X-gal kromogén szubsztrátot (5-bróm-4-klór-3-indol-β-D-galaktozid) kéket termelni, így a törzs kék színűvé válik.Amikor az exogén DNS-t beépítik, a LacZ gén nem expresszálható, és a törzs fehér, hogy a rekombináns baktériumokat szűrni lehessen.Ezt kék-fehér szűrésnek hívják.
17. Cisz-ható elem: A DNS-ben lévő bázisok specifikus szekvenciája, amely szabályozza a génexpressziót.
18. Klenow enzim: A DNS polimeráz I nagy fragmentuma, kivéve, hogy az 5' 3' exonukleáz aktivitást eltávolítják a DNS polimeráz I holoenzimből
19. Rögzített PCR: az egyik végén ismert szekvenciával rendelkező, számunkra érdekes DNS amplifikálására szolgál.Az ismeretlen szekvencia egyik végéhez poli-dG farkot adtunk, majd a poli-dC-t és az ismert szekvenciát primerként használták a PCR-amplifikációhoz.
20. Fúziós fehérje: Az eukarióta fehérje génje exogén génhez kapcsolódik, és az eredeti génfehérje és az exogén fehérje transzlációjából álló fehérje egyszerre expresszálódik.
Egyéb molekuláris biológiai kifejezések
1. A DNS fizikai térképe a DNS-molekula (restrikciós endonukleázzal emésztett) fragmentumainak sorrendje.
2. Az RNáz hasítása két típusra oszlik (autokatalízis) és (heterokatalízis).
3. A prokariótákban három iniciációs faktor létezik: (IF-1), (IF-2) és (IF-3).
4. A transzmembrán fehérjék irányítást igényelnek (jelpeptidek), a fehérje chaperonok szerepe pedig (segíti a peptidláncot a fehérje natív konformációjába hajtani).
5. A promoterekben lévő elemek általában két típusra oszthatók: (mag promoter elemek) és (upstream promoter elemek).
6. A molekuláris biológia kutatási tartalma alapvetően három részből áll: (szerkezeti molekuláris biológia), (génexpresszió és szabályozás), valamint (DNS-rekombinációs technológia).
7. A két kulcskísérlet, amely bizonyítja, hogy a DNS a genetikai anyag, a következők (egerek pneumococcus fertőzése) és (Escherichia coli T2 fágfertőzése).lehetséges).
8. Két fő különbség van a hnRNS és az mRNS között: (a hnRNS az mRNS-vé való átalakulás folyamatában splicing), (az mRNS 5' végét m7pGppp sapkával adjuk hozzá, és az mRNS sav (polyA) farok 3' végén extra poliadeniláció van).
9. A több alegységből álló fehérjeforma előnyei a következők: (az alegység gazdaságos módszer a DNS hasznosítására), (csökkentheti a fehérjeszintézis véletlenszerű hibáinak fehérjeaktivitásra gyakorolt hatását), (az aktivitás nagyon hatékonyan és gyorsan nyitható és zárható).
10. A fehérje feltekeredési mechanizmus első nukleáció elméletének fő tartalma a következőket tartalmazza: (nukleáció), (strukturális dúsítás), (végső átrendeződés).
11. A galaktóz kettős hatással van a baktériumokra;egyrészt (szénforrásként használható a sejtnövekedéshez);másrészt (ez is a sejtfal alkotóeleme).Ezért egy cAMP-CRP-független S2 promoterre van szükség a permanens szintézishez a háttér szintjén;ugyanakkor egy cAMP-CRP-függő S1 promoterre van szükség a magas szintű szintézis szabályozásához.A transzkripció (S2)-ből G-vel és (S1)-ből G-vel kezdődik.
12. A rekombináns DNS technológia (génklónozás) vagy (molekuláris klónozás) néven is ismert.A végső cél (az egyik szervezetben lévő genetikai információs DNS átvitele egy másik szervezetbe).Egy tipikus DNS-rekombinációs kísérlet általában a következő lépéseket tartalmazza: (1) Kivonjuk a donor szervezet célgénjét (vagy exogén génjét), majd enzimatikusan összekapcsoljuk egy másik DNS-molekulával (klónozó vektorral), hogy új rekombináns DNS-molekulát hozzunk létre.② A rekombináns DNS-molekula átkerül a recipiens sejtbe, és a recipiens sejtben replikálódik.Ezt a folyamatot transzformációnak nevezik.③ Szűrje ki és azonosítsa azokat a befogadó sejteket, amelyek felszívták a rekombináns DNS-t.④Tenyésztsük a nagy mennyiségben rekombináns DNS-t tartalmazó sejteket, hogy kimutathassuk, expresszálódik-e az idegen segédgén.
13. A plazmidreplikációnak két típusa van: a gazdasejt fehérjeszintézis által szigorúan szabályozottakat (tight plazmidoknak), a gazdasejt fehérjeszintézis által szigorúan nem szabályozottakat pedig (relaxált plazmidoknak) nevezzük.
14. A PCR reakciórendszernek a következő feltételekkel kell rendelkeznie: a.DNS-primerek (körülbelül 20 bázis), amelyek az elválasztandó célgén két szálának mindkét végén komplementer szekvenciákkal rendelkeznek.b.Termikus stabilitású enzimek, mint például: TagDNS polimeráz.c, dNTPd, az érdeklődésre számot tartó DNS-szekvencia templátként
15. A PCR alapvető reakciófolyamata három szakaszból áll: (denaturáció), (annealing) és (kiterjesztés).
16. A transzgenikus állatok alapvető folyamata általában a következőkből áll: ①Klónozott idegen gén bejuttatása megtermékenyített petesejt vagy embrionális őssejt sejtmagjába;②A beoltott megtermékenyített petesejt vagy embrionális őssejt átültetése a női méhbe;③Teljes embrionális fejlődés és növekedés Idegen génekkel rendelkező utódok számára;④ Használja ezeket az idegen fehérjéket termelő állatokat tenyészállományként új homozigóta vonalak tenyésztéséhez.
17. A hibridóma sejtvonalak a (lép B) sejtek (myeloma) sejtekkel történő hibridizálásával jönnek létre, és mivel (lépsejtek) képesek a hipoxantint hasznosítani, és (csontsejtek) sejtosztódási funkciókat biztosítanak, ezért HAT táptalajban tenyészthetők.nő.
18. A kutatás elmélyülésével az antitestek első generációját (poliklonális antitestek), a második generációt (monoklonális antitestek), a harmadik generációt (génsebészeti antitestek) nevezik.
19. A rovarvírusok géntechnológiája jelenleg főként a bakulovírusra irányul, ami az (exogén toxin gén) bejuttatásában nyilvánul meg;(a rovarok normális életciklusát megzavaró gének);(a vírus gének módosítása).
20. Az emlős RNS-polimeráz II promoterében a TATA, GC és CAAT közös elemeinek megfelelő transz-ható fehérjefaktorok (TFIID), (SP-1) és (CTF/NF1).
huszonegy.Az RNS-polimeráz Ⅱ alapvető transzkripciós faktorai a TFⅡ-A, TFⅡ-B, TFII-D, TFⅡ-E, kötőszekvenciájuk pedig: (D, A, B, E).Ahol a TFII-D funkciója (kötés a TATA dobozhoz).
húszonkettő.A legtöbb transzkripciós faktor, amely a DNS-hez kötődik, dimerek formájában működik.A DNS-hez kötődő transzkripciós faktorok funkcionális doménjei általában a következők (hélix-turn-helix), (cink ujj motívum), (bázis-leucin) cipzár motívum).
huszonhárom.Háromféle restrikciós endonukleáz hasítási mód létezik: (vágás a szimmetriatengely 5' oldalán, hogy 5'-es ragadós végeket hozzon létre), (vágás a szimmetriatengely 3' oldalán, hogy 3'-es ragadós végeket hozzon létre (a szimmetriatengely vágása lapos szegmensek létrehozásához) ).
huszonnégy.A plazmid DNS-nek három különböző konfigurációja van: (SC konfiguráció), (oc konfiguráció), (L konfiguráció).Az első az elektroforézisben (SC konfiguráció).
25. Exogén génexpressziós rendszerek, főleg (Escherichia coli), (élesztő), (rovar) és (emlős sejttábla).
26. A transzgenikus állatok esetében általánosan használt módszerek: (retrovirális fertőzési módszer), (DNS mikroinjekciós módszer), (embrionális őssejt módszer).
Alkalmazás Molekuláris biológia
1. Nevezze meg 5-nél több RNS funkcióját?
Transzfer RNS tRNS Transzfer aminosav Riboszóma RNS rRNS A riboszóma a hírvivő RNS mRNS Fehérje szintézis templáta Heterogén nukleáris RNS hnRNS Érett mRNS prekurzora kis nukleáris RNS snRNS Részt vesz a hnRNS splicingben Kis citoplazmatikus RNS felismerés AntRNS komponensek szinkronizált RNS szignálizált sejtRNS és plazma lokált sejtrNS szignálizált /micRNS Szabályozza a génexpressziót Ribozim RNS Enzimatikusan aktív RNS
2. Mi a fő különbség a prokarióta és eukarióta promóterek között?
Prokarióta TTGACA --- TATAAT------Beavatási hely-35 -10 Eukarióta Enhancer---GC ---CAAT----TATAA-5mGpp-Kezdési hely-110 -70 -25
3. Melyek a természetes plazmidok mesterséges megalkotásának fő szempontjai?
A természetes plazmidok gyakran hibásak, ezért nem alkalmasak génsebészeti hordozóként való felhasználásra, ezért módosítani és megszerkeszteni kell őket: a.Adjon hozzá megfelelő szelekciós marker géneket, például kettőt vagy többet, amelyek könnyen használhatók a szelekcióhoz, általában antibiotikum géneket.b.Növelje vagy csökkentse a megfelelő enzimvágási helyeket a rekombináció elősegítése érdekében.c.Csökkentse le a hosszt, vágja le a felesleges töredékeket, javítsa az import hatékonyságát és növelje a rakodási kapacitást.d.Változtassa meg a replikont, szűkről lazára, kevesebb példányról több példányra.e.Adjon hozzá speciális genetikai elemeket a géntechnológia speciális követelményeinek megfelelően
4. Mondjon példát a szövetspecifikus cDNS differenciális szűrésére?
Két sejtpopulációt készítünk, a célgén expresszálódik vagy erősen expresszálódik az egyik sejtben, és a célgén nem, vagy csak csekély mértékben expresszálódik a másik sejtben, majd hibridizációval és összehasonlítással megtalálják a célgént.Például a daganatok előfordulása és kialakulása során a tumorsejtek a normál sejtektől eltérő expressziós szinttel rendelkező mRNS-eket mutatnak be.Ezért a tumorral kapcsolatos gének differenciális hibridizációval kiszűrhetők.Az indukciós módszerrel kiszűrhetők azok a gének is, amelyek expresszióját indukálják.
5. Hibridóma sejtvonalak generálása és szűrése?
Lép B-sejtek + mielómasejtek, polietilénglikolt (PEG) adjunk hozzá a sejtfúzió elősegítésére, és a lép B-myeloma fúziós sejtek HAT-tápközegben (hipoxantint, aminopterint, T-t tartalmazó) tenyésztve tovább tágulnak.A sejtfúzió tartalmaz: lép-lép fúziós sejteket: nem képesek növekedni, lépsejtek nem tenyészthetők in vitro.Csont-csont fúziós sejtek: nem tudják hasznosítani a hipoxantint, de a folát-reduktáz segítségével a második úton purint szintetizálnak.Az aminopterin gátolja a folát reduktázt, ezért nem tud növekedni.Csont-lép fúziós sejtek: növekedhetnek HAT-ban, a lépsejtek hipoxantint hasznosíthatnak, a csontsejtek pedig sejtosztódási funkciót biztosítanak.
6. Mi az elve és módszere a DNS primer szerkezetének didezoxiterminális terminációs módszerrel (Sanger-módszer) történő meghatározásának?
Az elv az, hogy egy nukleotidlánc-terminátort – 2,,3,-didezoxinukleotidot – használjunk a DNS kiterjesztésének leállítására.Mivel hiányzik belőle a 3/5/foszfodiészter kötések kialakításához szükséges 3-OH, miután beépült a DNS-láncba, a DNS-lánc nem hosszabbítható tovább.A bázispárosítás elve szerint, amikor a DNS-polimeráznak szüksége van a dNMP-re a normálisan megnyúlt DNS-láncban való részvételhez, két lehetőség van, az egyik a ddNTP-ben való részvétel, ami a dezoxinukleotid lánchosszabbítás befejezését eredményezi;a másik a dNTP-ben való részvétel, hogy a DNS-lánc továbbra is megnyúlhasson a következő ddNTP beépüléséig.Ezzel a módszerrel különböző hosszúságú, ddNTP-re végződő DNS-fragmensek csoportja nyerhető.A módszer az, hogy négy csoportra osztjuk: ddAMP, ddGMP, ddCMP és ddTMP.A reakció után a poliakrilamid gélelektroforézis képes leolvasni a DNS-szekvenciát az úszósávok szerint.
7. Mi az aktivátor fehérje (CAP) pozitív szabályozó hatása a transzkripcióra?
Ciklikus adenilát (cAMP) receptor fehérje CRP (cAMP receptor protein), a cAMP és CRP kombinációjából létrejövő komplexet CAP-nak (cAMPaktivált fehérje) nevezik.Ha az E. colit glükózmentes tápközegben növesztjük, a CAP szintézise fokozódik, és a CAP-nak az a funkciója, hogy aktiválja a promotereket, például a laktózt (Lac).Egyes CRP-függő promoterekből hiányzik a tipikus -35 régió szekvencia jellemzője (TTGACA), amely a közös promoterekkel rendelkezik.Ezért az RNS polimeráz nehezen kötődik hozzá.CAP jelenléte (funkció): jelentősen javíthatja az enzim és a promoter kötési állandóját.Elsősorban a következő két aspektust mutatja: ① A CAP a promoter konformációjának és az enzimmel való kölcsönhatásnak a megváltoztatásával segíti az enzimmolekulát a helyes orientációban, így a -10 régióval egyesül és a -35 régió funkcióját helyettesíti.② A CAP gátolhatja az RNS-polimeráz kötődését a DNS más helyeihez is, ezáltal növelve a specifikus promoteréhez való kötődés valószínűségét.
8. Milyen lépéseket tartalmaznak általában egy tipikus DNS-rekombinációs kísérlet?
a.Kivonja a donor szervezet célgénjét (vagy exogén génjét), és enzimatikusan kapcsolja össze egy másik DNS-molekulával (klónozó vektor), hogy új rekombináns DNS-molekulát hozzon létre.b.Vigye át a rekombináns DNS-molekulát a recipiens sejtbe, és replikálja és őrizze meg a befogadó sejtben.Ezt a folyamatot transzformációnak nevezik.c.Szűrje ki és azonosítsa azokat a befogadó sejteket, amelyek felszívták a rekombináns DNS-t.d.A rekombináns DNS-t tartalmazó sejtek tömeges tenyésztése annak kimutatására, hogy expresszálódik-e az idegen segédgén.
9. Génkönyvtár felépítése A rekombinánsok szűrésére három módszert adunk meg, és röviden leírjuk a folyamatot.
Antibiotikum rezisztencia szűrés, inszerciós rezisztencia inaktiválás, kék-fehér folt szűrés vagy PCR szűrés, differenciál szűrés, DNS próba A legtöbb klónozó vektor antibiotikum rezisztencia géneket (anti-ampicillin, tetracyclin) hordoz.Amikor a plazmidot Escherichia coli-ba visszük át, a baktériumok rezisztenciát szereznek, és azok, amelyek nem kerültek át, nem lesznek rezisztensek.De nem tudja megkülönböztetni, hogy átszervezték-e vagy sem.Két rezisztenciagént tartalmazó vektorban, ha az egyik génbe idegen DNS-fragmentumot inszertálnak, és a gén inaktiválását okozza, két különböző gyógyszert tartalmazó lemezkontroll használható a pozitív rekombinánsok szűrésére.Például a pUC plazmid tartalmazza a LacZ gént (a β-galaktozidázt kódolja), amely képes lebontani az X-gal kromogén szubsztrátot (5-bróm-4-klór-3-indol-β-D-galaktozid), és kék színt hoz létre, így a törzs kék színűvé válik.Amikor az idegen DNS-t beépítik, a LacZ gén nem expresszálható, és a törzs fehér, hogy a rekombináns baktériumokat szűrje.
10. Ismertesse a transzgenikus állatok embrionális őssejteken keresztül történő kinyerésének alapvető folyamatát?
Az embrionális őssejtek (ES) olyan embrionális sejtek az embrionális fejlődés során, amelyek mesterségesen tenyészthetők és szaporíthatók, és más típusú sejtekké differenciálódnak.ES-sejtek tenyésztése: A blasztociszta belső sejttömegét izoláljuk és tenyésztjük.Ha az ES-t feeder-mentes rétegben tenyésztjük, akkor különféle funkcionális sejtekké differenciálódik, például izomsejtekké és N-sejtekké.Ha fibroblasztokat tartalmazó tápközegben tenyésztjük, az ES fenntartja a differenciálódási funkciót.Az ES genetikailag manipulálható, és a differenciációs funkciója integrálható anélkül, hogy befolyásolná a differenciációs funkcióját, ami megoldja a véletlenszerű integráció problémáját.Helyezzen be exogén géneket az embrionális őssejtekbe, majd ültesse be vemhes nőstény egerek méhébe, fejlődjön ki kölykökké, és keresztezze homozigóta egereket.
