1. Határozza meg az RNS-oldat abszorbanciáját
A 280, 320, 230 és 260 nm-en mért abszorbancia a nukleinsav, a háttér (oldat zavarossága), a sókoncentráció és a szerves anyagok, például a fehérje értékeket jelenti.Általában csak az OD260/OD280-at nézd (arány, R).Ha 1,8-2,0, akkor azt gondoljuk, hogy az RNS-ben fehérje vagy más szerves anyag szennyeződése tolerálható, de meg kell jegyezni, hogy ha Tris-t használunk pufferként az abszorbancia kimutatására, az R érték nagyobb lehet 2-nél (általában <2,2-nek kell lennie).Ha R<1,8, akkor nyilvánvalóbb a fehérje vagy más szerves anyag szennyeződése az oldatban, és az RNS sorsa az igények szerint meghatározható.Ha R>2,2, az azt jelenti, hogy az RNS egyetlen nukleinsavvá hidrolizálódott.
2. Az RNS elektroforetikus mintázata
Általában denaturáló gélt használnak RNS elektroforézisre, de ha csak az RNS minőségének kimutatására szolgál, akkor nincs szükség denaturáló gélre, hanem használható a közönséges agaróz gél is.Az elektroforézis célja a 28S és 18S sávok integritásának és azok arányának, illetve az mRNS kenet integritásának kimutatása.Általában, ha a 28S és 18S sávok világosak, tiszták és élesek (a sávok élei tiszták), és a 28S fényessége több mint kétszerese a 18S sávénak, akkor az RNS minőségét jónak tekintjük.
A fenti két módszert általában használjuk, de e két módszer egyike sem tudja egyértelműen megmondani, hogy van-e maradék RNáz az RNS-oldatban.Ha nagyon kis mennyiségű RNáz van az oldatban, akkor azt a fenti módszerrel nehezen tudjuk kimutatni, de az ezt követő enzimreakciók nagy része 37 fok feletti hőmérsékleten és hosszan megy végbe.Ily módon, ha nagyon kevés RNáz van az RNS-oldatban, akkor nagyon megfelelő környezet és idő lesz a szerepük betöltésére a későbbi kísérletekben, és természetesen a kísérlet hideg lesz ilyenkor.Az alábbiakban bemutatunk egy módszert, amely megerősítheti, hogy van-e maradék RNáz az RNS-oldatban.
3. Hőmegőrzési teszt
Az RNS-oldatból a mintakoncentrációnak megfelelően vegyünk ki két darab 1000 ng RNS-t és adjuk egy 0,5 ml-es centrifugacsőbe, és egészítsük ki pH 7,0 Tris pufferrel 10 ul össztérfogatig, majd zárjuk le a cső kupakját.Tegyük az egyiket állandó hőmérsékletű, 70°C-os vízfürdőbe, és tartsuk melegen 1 órán át.A másik részt -20°C-os hűtőszekrényben 1 órán át tároltuk.Ha letelt az idő, vegye ki a két mintát az elektroforézishez.Az elektroforézis befejezése után hasonlítsa össze a kettő elektroforetikus sávját.Ha a kettő sávjai konzisztensek, vagy nincs szignifikáns különbség (természetesen a sávjaik is megfelelnek a 2. módszer feltételeinek), az azt jelenti, hogy az RNS-oldatban nincs maradék RNáz szennyeződés, és az RNS minősége nagyon jó.Ellenkezőleg, ha a 70 °C-on inkubált minta nyilvánvaló lebomlást mutat, az azt jelzi, hogy az RNS-oldat RNáz-szennyeződést tartalmaz.
2 Kísérleti módszerek és technikák RNS extrakcióra
Az RNS extrakciója során gyakran találkozunk a következő problémákkal: (1) az RNS-hozam alacsony;(2) az RNS súlyos sószennyezést tartalmaz;(3) az RNS-ben komoly szerves oldószerszennyezés van;(4) mintaromlás és egyéb problémák
1. Általánosan használt teljes RNS extrakciós reagensek
A guanidin-izotiocianát módszer és a Trizol módszer a leggyakrabban használt módszerek a teljes RNS állati szövetekből és állati sejtekből történő kivonására.Különösen alkalmas kis mintákhoz és különösen nehezen kinyerhető szövetekhez, mint például a teljes RNS extrakciója nyúlbőrből és állati kötőszövetből;emellett a Trizol általános célú lízisreagensként növényi szövetek, baktériumok, gombák és más szövetek extrakciójára is használható.A poliszacharidokat és polifenolokat tartalmazó növényi szövetek, például a camellia oleifera, a tealevelek, a repce stb. esetében a CTAB-módszer használható a teljes RNS kinyerésére is.
Hagyományos módszerként a kétoszlopos módszer is nagyon népszerű, mivel normál hőmérsékleten működik, nincs szükség RNáz hozzáadására, és biztonságos – nincs szükség kloroformra, fenolokra és egyéb szerves reagensekre az extrakcióhoz.(ajánlott termékek )
2. A teljes RNS kinyerése állati szövetekből
(1) Próbáljon friss papírzsebkendőt választani, ha nem friss (lehetőleg három hónapon belül - 80 ℃ hűtőszekrényben vagy folyékony nitrogénben lefagyasztva. Szövet vágásakor ne vágja közvetlenül szobahőmérsékleten, ügyeljen arra, hogy tegye a jégszekrényre, kerülje az ismételt fagyasztást és felengedést.
(2) Tiszta ollóval és csipesszel vágjon le egy kis szövetdarabot, a minta vágásakor próbálja meg a szövet középső részét levágni, vagy először vágja le a nagy szövetdarabot a közepétől, majd vágja le a mintát a friss bemetszés helyén.Az eltávolított szövetet teljesen fel kell aprítani, az aprított szövetet egy RNáz nélküli EP-csőbe kell helyezni, hozzáadni a lizátumot, az aprított szövetet teljesen ki kell tenni a lizátumnak, és elő kell készíteni a homogenizálásra.
(3) Normál szövetekhez válasszon mungóbab méretű szöveteket (30-60 mg) a homogenizáláshoz.Ha a szövetek nagy mennyiségű fehérjét, zsírt vagy sűrű rostos szövetet, például májat tartalmaznak, megfelelően növelje vagy csökkentse a vágott szövetek mennyiségét (opcionális) Válasszon 10-20 mg-ot.
(4) Ha halizmot, garnélarákhúst, medúzát és más magas víztartalmú szöveteket extrahálunk, a minta térfogatát megfelelően növelni kell (ajánlott 100-200 mg).
(5) Ha a körülmények megengedik, az állati szövet nagy áteresztőképességű szövethomogenizátorral történő homogenizálás után közvetlenül extrahálható, ha ilyen berendezés nincs.
(6) A végső extrakció után kapott RNS-t azonnal a jégszekrényre kell helyezni, hogy csökkentsük az RNS lebomlását.
3. Állati sejt RNS extrakció
(1) Szuszpenziós sejtek: centrifugálja közvetlenül, és dobja ki a tápközeget, mossuk steril PBS-sel 1-2 alkalommal, majd szuszpendáljuk megfelelő mennyiségű PBS-sel, majd adjunk hozzá lizátumot a lízishez.Ne adja a lizátumot közvetlenül a kicsapódott sejtekhez a folyadék teljes kiöntése után.Ez azt eredményezi, hogy a külső rétegen lévő lizált sejtek után felszabaduló hisztoncsomag a kicsapódott sejtek külső oldalához tapad, ezáltal korlátozza a pellet belsejében lévő sejtek érintkezését a lizátummal., ami nem teljes sejtlízist és csökkent RNS-hozamot eredményez.
(2) Félig tapadó vagy nem szorosan tapadó sejtek: A táptalaj eldobása után 1-2 alkalommal mossuk PBS-sel, majd közvetlenül szívjunk fel megfelelő mennyiségű PBS-t, és pipettával vagy pisztollyal fújjuk ki a tenyésztőedényt, hogy lefújjuk a sejteket, majd vigyük át RNS-mentes sejtekbe.Adja hozzá a lizátumot az enzim EP csövéhez extrakcióhoz.
(3) Tapadó sejteket: először tripszinnel kell emészteni, majd RNáz-mentes EP-csövekbe kell gyűjteni, centrifugálni a felülúszó eltávolításához, 1-2 alkalommal mosni PBS-sel a felesleges tripszin eltávolítása érdekében, majd megfelelő mennyiségű PBS-sel újraszuszpendálni. Ezután folytassa az extrakciós lépéssel.
4. Növényi RNS extrakció
A növényi szövetek fenolos vegyületekben vagy poliszacharidokban gazdagok, vagy azonosítatlan másodlagos metabolitokat tartalmaznak, vagy magas az RNáz aktivitása.Ezek az anyagok a sejtlízis után szorosan összekapcsolódnak az RNS-sel, így oldhatatlan komplexeket vagy kolloid csapadékot képeznek, amelyeket nehéz eltávolítani.Ezért amikor növényi szövetet kinyerünk, egy készletet kell választanunk a növények számára.A készletben található lizátum hatékonyan képes megoldani a polifenolok könnyű oxidációjával és a poliszacharid vegyületek és nukleinsavak elválasztásával kapcsolatos problémákat.
(A poliszacharid polifenol növényi RNS extrakcióhoz ajánlott termékek:
(1) A növény héját, héját, magjait, leveleit stb. teljesen le kell őrölni egy mozsárban.Az őrlési folyamat során a folyékony nitrogént időben pótolni kell, hogy elkerüljük a minta megolvadását.Az őrölt mintát gyorsan hozzá kell adni a lizátumhoz, és fel kell rázni az RNS lebomlásának elkerülése érdekében.
(2) Rostban gazdag minták, például rizs és búzalevelek esetében az extrakció mennyiségét megfelelően csökkenteni kell, különben a szövet őrlése és lízise nem lesz teljes, ami az extrahált RNS alacsony hozamát eredményezi.
(3) A magas víztartalmú növényi szövetek esetében, mint például a gránátalma gyümölcse, a görögdinnye gyümölcse, az őszibarack gyümölcse stb., a minta méretét megfelelően növelni kell (100-200 mg nem kötelező).
(4) A növényi szövetekhez, például a növényi levelekhez, rizómákhoz, kemény termésekhez és más anyagokhoz általában ajánlott folyékony nitrogént használni a habarcsban lévő összetevők alapos habarcsához, majd folytassa az extrakciós lépéssel.Előfordulhat, hogy a hagyományos szövethomogenizátorok nem hatékonyak a növényi szövetek homogenizálásában, és általában nem ajánlottak.
5. Óvintézkedések az RNS-kivonáshoz
(1) A szövetmintáknak a lehető legfrissebbeknek kell lenniük az ismételt fagyasztás és felengedés elkerülése érdekében.
(2) Az extrakció során a szövetet teljesen meg kell őrölni, és a szövet mennyisége nem lehet túl kevés, nem is beszélve túl sok.
(3) A lizátum hozzáadása után elegendő inkubációs időt kell biztosítani a minta teljes lizálásához.
(4) A Trizol-módszer extrakciós alkalmazásakor a rétegződés utáni felülúszó felszívásának elve az, hogy "inkább kevesebbet lélegezzen be, mint többet", és nem szabad a középső rétegig kivonni, különben súlyos genomi DNS-szennyeződést okoz.
(5) Mosáskor a mosófolyadéknak teljesen be kell szivárognia a cső fala köré, hogy biztosítsa az alapos mosást.
(6) Az oszlopextrakciós módszernél az oszlop mosás utáni leválasztása mellett az adszorpciós oszlopot ultratiszta munkaasztalba is kell helyezni, és 5-10 percig fújni kell, hogy a szerves oldószer teljesen szárazra párologjon.
(7) Az oszlopos módszer utolsó elúciójánál a DEPC víz hozzáadása után 3-5 percig kell inkubálni, vagy a DEPC vizet előzetesen 60°C-ra kell melegíteni az elúciós hozam növelése érdekében.A hagyományos Trizol hasítási és izopropanolos precipitációs módszernél a végső RNS-t DEPC vízben oldják fel, így megfelelő időt kell adni az oldódásra, és a centrifugacső alját folyamatosan pipettahegygel fújni kell.
3 TAz alacsony RNS-koncentráció/rossz minőség okai és megoldásai
1. A hozam túl alacsony
A kivont minta túl alacsony, a teljes mennyiség nem elegendő, vagy a kivont minta túl sok, és a lízis nem teljes;az extrakcióhoz megfelelő minőségű szövetet vagy sejteket kell felhasználni, a minta előkezelését jól kell elvégezni, a lízisnek elegendőnek kell lennie.
2. Genom maradványok
Trizol módszerrel történő extrahálásnál, amikor a felülúszót rétegezés után a középső rétegbe szívják, súlyos genomszennyeződést okoz;rétegezésnél fokozottan ügyelni kell, nehogy a középső rétegbe szívódjon.Ha az extrakciót oszlopos módszerrel végezzük, akkor az extrakcióhoz egy DNáz I-et tartalmazó készlet választható.A membránon adszorbeált nukleinsavat közvetlenül DNáz I-gyel emésztjük, ami nagymértékben csökkentheti a DNS-maradékokat.
3. RNS degradáció
Ez lehet magának a kivont mintának a lebomlása, vagy az extrakciós folyamat során okozott degradáció;Az RNS-kivonáshoz lehetőség szerint friss mintákat kell használni, és az összegyűjtött mintákat folyékony nitrogénben vagy -80°C-os hűtőszekrényben kellő időben tárolni, az ismételt fagyasztást és felengedést kerülni.RNáz/DNáz mentes hegyeket, centrifugacsöveket és egyéb anyagokat kell használni az RNS extrakciós folyamatban.Az extrakciós folyamatnak a lehető leggyorsabbnak kell lennie.Az extrahált RNS-t jégdobozra kell helyezni, és időben -80 °C-on kell tárolni.Ha az extrahált RNS-t gélelektroforézissel kell kimutatni, az extrakció után azonnal elektroforézist kell végezni, és az elektroforézis puffert újonnan készített pufferre kell cserélni.
4. Só és szerves oldószer maradványok
Az extrakciós reagensek fenolt és guanidinsókat, a mosóoldat etanolt tartalmaznak.Az extrakciós folyamat során a lizátum nem szívódott fel teljesen és dobta ki, és a mosóoldat nem száradt meg teljesen.A maradék sók és szerves oldószerek károsak a későbbi reverz transzkripcióra és PCR-re.Különböző fokú gátlás, így az extrakció során a szöveti lizátumot teljesen el kell távolítani, és a mosásnak elegendőnek kell lennie ahhoz, hogy a cső környező falait le lehessen mosni.Ezen túlmenően, a cső kiürítése és fújása egy szükséges lépés, amely tovább csökkenti a szerves anyag maradékát.
Az RNS extrakcióval kapcsolatos további információkért kérjük, kövesse weboldalunkat:
www.foreivd.com további információért.
Feladás időpontja: 2022. december 01
