Számomra a detektálási technológia történetében több forradalmi találmány az antigén-antitest specifikus kötődés elvén alapuló immunjelölő technológia, a PCR technológia és a szekvenálási technológia.Ma a PCR technológiáról fogunk beszélni.A PCR technológia fejlődésének megfelelően az emberek a PCR technológiát általában három generációra osztják: hagyományos PCR technológiára, valós idejű fluoreszcens kvantitatív PCR technológiára és digitális PCR technológiára.
Celterjedt PCR technika
KARY MULLIS (1944.12.28-2019.8.7.)
Kary Mullis 1983-ban találta fel a polimeráz láncreakciót (polimeráz láncreakció, PCR). Azt mondják, amikor a barátnőjét vezette, hirtelen felvillant benne az ihlet, és a PCR elve jutott eszébe (a vezetés előnyeiről).Kary Mullis 1993-ban megkapta a kémiai Nobel-díjat. A New York Times megjegyezte: "Rendkívül eredeti és jelentős, szinte felosztja a biológiát a PCR előtti és a PCR utáni korszakokra.
A PCR elve: A DNS-polimeráz katalízise során az anyaszálú DNS-t használják templátként, a specifikus primert pedig az extenzió kiindulópontjaként, valamint az anyaszál templát DNS-ével komplementer leányszálú DNS-t in vitro másolják denaturáció, annealizálás, extenzió és egyéb lépések során.Ez egy DNS-szintézis-amplifikációs technológia in vitro, amely gyorsan és specifikusan képes bármilyen cél DNS-t in vitro amplifikálni.
A hagyományos PCR előnyei
1.Klasszikus módszer, komplett nemzetközi és hazai szabványok
2.A műszerreagensek alacsonyabb költsége
3.A PCR-termékek kinyerhetők más molekuláris biológiai kísérletekhez
Ajánlott Foregene PCR gép: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Kapcsolódó termékek: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
A hagyományos PCR hátrányai
1.könnyen szennyezhető
2.nehézkes művelet
3.csak kvalitatív elemzés
4.Mérsékelt érzékenység
5.Nem specifikus erősítés van, és ha a nem specifikus sáv akkora, mint a célsáv, nem lehet megkülönböztetni
Capillaris elektroforézis alapú PCR
A szokásos PCR hiányosságaira válaszul egyes gyártók a kapilláris elektroforézis elvén alapuló műszereket vezettek be.A PCR-amplifikáció utáni elektroforézis lépés a kapillárisban befejeződik.Az érzékenység nagyobb, és a MAERKER segítségével több bázis különbsége is megkülönböztethető és az erősítés kiszámítható.termék tartalma.Hátránya, hogy a PCR terméket még fel kell nyitni és be kell helyezni a műszerbe, és továbbra is nagy a szennyeződés veszélye.
CapillarisEelektroforézis
2. Valós idejű fluoreszcens kvantitatív PCR (Quantitative Real-time PCR, qPCR) technológiaA fluoreszcens kvantitatív PCR, más néven Real-Time PCR, egy új nukleinsav-kvantitatív technológia, amelyet a PE (Perkin Elmer) fejlesztett ki 1995-ben. A fluoreszcens kvantitatív PCR fejlődéstörténete olyan óriások lelkesítő küzdelmeinek története, mint az ABI, a Roche és a Bio-Rad.Ha érdekel, megnézheted.Ez a technika jelenleg a legérettebb és legszélesebb körben használt szemikvantitatív PCR technika.
Ajánlott qPCR gép: https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
Fluoreszcens festék módszer (SYBR Green I):A SYBR Green I a kvantitatív PCR-hez leggyakrabban használt DNS-kötő festék, amely nem specifikusan kötődik a kettős szálú DNS-hez.Szabad állapotban a SYBR Green gyenge fluoreszcenciát bocsát ki, de miután kétszálú DNS-hez kötődik, fluoreszcenciája 1000-szeresére nő.Ezért a reakció által kibocsátott teljes fluoreszcens jel arányos a jelenlévő kettős szálú DNS mennyiségével, és az amplifikált termék növekedésével növekszik.Mivel a festék nem specifikusan kötődik a kettős szálú DNS-hez, téves pozitív eredmények születhetnek.
Kapcsolódó termékek: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/
Fluoreszcens szonda módszer (Taqman technológia): AlattPCR-amplifikáció esetén egy specifikus fluoreszcens próbát adunk hozzá egy primerpárral egyidejűleg.A próba egy lineáris oligonukleotid, amelynek mindkét végén egy fluoreszcens riportercsoport és egy fluoreszcens kioltócsoport van megjelölve.Ha a szonda sértetlen, a riportercsoport által kibocsátott fluoreszcens jelet a kvencsercsoport elnyeli, és a detektálás Nincs fluoreszcens jel;A PCR amplifikáció során (kiterjesztési szakaszban) a Taq enzim 5'-3' Dicer aktivitása megemészti és lebontja a próbát, így a riporter fluoreszcens csoport és a kioltó fluoreszcens csoport elválik, így a fluoreszcencia figyelő rendszer A fluoreszcens jel vétele, azaz minden alkalommal, amikor egy DNS-lánc képződik, a szinizálás befejeződik, a fluoreszcensz, a szinkronizálás befejeződik. fluoreszcens jelek és a PCR termékek képződése.A Taqman szonda módszer a leggyakrabban használt kimutatási módszer a klinikai kimutatásban.
Kapcsolódó termékek: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/
A qPCR előnyei
1.A módszer kiforrott, és a támogató berendezések és reagensek készen állnak
2.A reagensek közepes költsége
3.könnyen kezelhető
4.Magas detektálási érzékenység és specifitás
A qPCR hátrányai
A célgén mutációja az észlelés elmaradásához vezet.
Az alacsony koncentrációjú sablon észlelési eredménye nem határozható meg.
Nagy hiba lép fel a standard görbe használatakor a mennyiségi kimutatáshoz.
3. Digitális PCR (digitális PCR, dPCR) technológia
A digitális PCR a nukleinsavmolekulák abszolút mennyiségi meghatározására szolgáló technika.A qPCR-hez képest a digitális PCR közvetlenül képes leolvasni a DNS/RNS molekulák számát, ami a kiindulási mintában lévő nukleinsavmolekulák abszolút mennyiségi meghatározása.1999-ben Bert Vogelstein és Kenneth W. Kin-zler formálisan javasolta a dPCR koncepcióját.
2006-ban a Fluidigm volt az első, amely kereskedelmi forgalomban kapható chip-alapú dPCR műszert gyártott.2009-ben a Life Technologies piacra dobta az OpenArray és a QuantStudio 12K Flex dPCR rendszereket.2013-ban a Life Technologies elindította a QuantStudio 3DdPCR rendszert, amely nagy sűrűségű nanoméretű mikrofluidikus chip technológiát használ a minták egyenletes elosztására 20 000 egyedi sejt között.a reakciókútban.
2011-ben a Bio-Rad piacra dobta a cseppalapú QX100 dPCR műszert, amely víz az olajban technológiát alkalmazva egyenletesen osztja el a mintát 20 000 csepp víz az olajban módszerrel, és cseppelemzőt használ a cseppek elemzésére.2012-ben a RainDance piacra dobta a RainDrop dPCR műszert, amelyet nagynyomású gáz hajt, hogy az egyes szabványos reakciórendszereket 1 millió-10 millió pikoliteres mikrocseppet tartalmazó reakcióemulzióvá bontsa.
A digitális PCR eddig két fő csoportot alkotott, a chip típust és a csepptípust.Nem számít, milyen típusú digitális PCR, alapelvei a korlátozó hígítás, végpont PCR és Poisson-eloszlás.A nukleinsav templátokat tartalmazó standard PCR reakciórendszer egyenletesen van felosztva több tízezer PCR reakcióra, amelyeket chipekre vagy mikrocseppekre osztanak szét, így minden reakció a lehető legtöbb templát molekulát tartalmazza, és egy-molekulás templát PCR reakciót hajtanak végre.A fluoreszcencia leolvasásával Megszámoljuk a jel jelenlétét vagy hiányát, és az abszolút kvantifikációt a statisztikai Poisson-eloszlás kalibrálása után végezzük el.
Az alábbiak az általam használt digitális PCR platformok jellemzői:
1. Bio-Rad QX200 csepp digitális PCR Bio-RadA QX200 egy nagyon klasszikus digitális PCR platform, az alapvető detektálási folyamat: 20 000 mintát állít elő a cseppgenerátor A víz az olajban mikrocseppeket egy közönséges PCR gépen erősítik fel, végül az egyes mikrocseppek fluoreszcencia jelét egy mikrocsepp-olvasó olvassa le.A művelet bonyolultabb, a szennyezés kockázata közepes.
Xinyi TD1 mikrocsepp digitális PCRA Xinyi TD1 egy hazai digitális PCR platform, az alapvető detektálási folyamat: 30 000-50 000 víz az olajban cseppeket generál egy cseppgenerátoron keresztül, erősít egy közös PCR műszeren, és végül passzol A cseppleolvasó minden csepp fluoreszcens jelét olvassa.Mind a cseppek generálása, mind a leolvasás ezen a platformon egy dedikált chipben történik, alacsony szennyeződési kockázattal.
STILLA Naica mikrocsepp chip digitális PCRA STILLA Naica egy viszonylag új digitális PCR platform.Az alapvető kimutatási folyamat a következő: adjuk hozzá a reakcióoldatot a chiphez, helyezzük a chipet a mikrocsepp-generáló és amplifikációs rendszerbe, és hozzunk létre 30 000 mikrocseppet.Terítse a chipre, és a PCR-amplifikáció befejeződik a chipen.Ezután az erősített chipet a mikrocseppek leolvasását elemző rendszerbe visszük, és a fluoreszcens jelet képek készítésével olvassuk le.Mivel a teljes folyamat zárt chipben zajlik, a szennyeződés kockázata alacsony.
4. ThermoFisher QuantStudio 3D chip digitális PCR
A ThermoFisher QuantStudio 3D egy másik klasszikus chip alapú digitális PCR platform.Alapvető kimutatási folyamata: a reakcióoldatot a szórófejbe öntjük, majd a reakcióoldatot egyenletesen oszlassuk el a chipen 20.000 mikrolyukkal a szórón keresztül., helyezze a chipet a PCR gépre, hogy erősítse, végül helyezze be a chipet az olvasóba, és készítsen egy fényképet, hogy leolvassa a fluoreszcens jelet.A művelet viszonylag bonyolult, és az egész folyamat zárt chipben zajlik, a szennyeződés kockázata alacsony.
5. JN MEDSYS Clarity chip digitális PCR
A JN MEDSYS Clarity egy viszonylag új chip típusú digitális PCR platform.Alapvető kimutatási folyamata a következő: a reakcióoldatot az applikátorba öntjük, majd az applikátoron keresztül egyenletesen eloszlatjuk a reakcióoldatot a PCR csőben rögzített 10 000 PCR csőre.A mikropórusos chipen a reakcióoldat kapilláris hatáson keresztül jut be a chipbe, majd a PCR-csövet a chippel a PCR-gépre helyezzük erősítésre, végül a chipet az olvasóba helyezzük, hogy a fluoreszcens jelet fénykép készítésével leolvassuk.A művelet bonyolultabb.A szennyeződés kockázata alacsony.
Az egyes digitális PCR-platformok paramétereit az alábbiakban foglaljuk össze:
A digitális PCR platform értékelési mutatói: az osztott egységek száma, a fluoreszcens csatornák száma, a működés bonyolultsága és a szennyeződés kockázata.De a legfontosabb az észlelési pontosság.A digitális PCR-platformok értékelésének egyik módja az, ha több digitális PCR-platformot használnak egymás ellenőrzésére, egy másik módja pedig a pontos értékekkel rendelkező standard anyagok használata.
A dPCR előnyei
1.Az abszolút számszerűsítés elérése
2.Magasabb érzékenység és specifitás
3.Képes kimutatni az alacsony példányszámú mintákat
A dPCR hátrányai1. Drága berendezések és reagensek 2. Bonyolult működés és hosszú észlelési idő 3. Szűk érzékelési tartomány
Jelenleg a PCR technológia három generációjának megvannak a maga előnyei és hátrányai, és mindegyiknek megvannak a maga alkalmazási területei, és nem az a kapcsolat, hogy egyik generáció felváltja a másikat.A technológia folyamatos fejlődése új életerőt adott a PCR-technológiának, lehetővé téve az egyik alkalmazási irány feloldását a másik után, így kényelmesebb és pontosabb a nukleinsav-detektálás.
Forrás: Dr. Yuan tesztelésre visz
Ajánlott termékek:
Feladás időpontja: 2022.11.18
