• A PCR egy olyan módszer, amellyel kis mennyiségű DNS-templátból DNS-t amplifikálnak.Az RT-PCR reverz transzkripciót használ, hogy DNS-templátot állítson elő egy RNS-forrásból, amely azután amplifikálható.
• A PCR és RT-PCR tipikusan végponti reakciók, míg a qPCR és RT-qPCR a termékszintézis sebességének kinetikáját használja a PCR reakció során a jelenlévő templát mennyiségének meghatározására.
• Az újabb módszerek, mint például a digitális PCR, biztosítják a kezdeti DNS-templát abszolút mennyiségi meghatározását, míg az olyan módszerek, mint az izotermikus PCR, csökkentik a drága berendezések szükségességét a megbízható eredmények biztosításához.

A polimeráz láncreakció (PCR) egy viszonylag egyszerű és széles körben használt molekuláris biológiai technika DNS és RNS szekvenciák amplifikálására és kimutatására.A hagyományos DNS-klónozási és -amplifikációs módszerekkel összehasonlítva, amelyek gyakran napokig is eltarthatnak, a PCR csak néhány órát vesz igénybe.A PCR nagyon érzékeny, és minimális templát igényel specifikus szekvenciák kimutatásához és amplifikálásához.Az alapvető PCR-módszerek tovább fejlődtek az egyszerű DNS- és RNS-detektáláshoz képest.Az alábbiakban áttekintést adunk a különböző PCR-módszerekről és a reagensekről, amelyeket az Enzo Life Sciences biztosít az Ön kutatási igényeihez.Célunk, hogy segítsük a tudósokat gyorsan hozzáférni a PCR-reagensekhez, amelyeket a következő kutatási projektjükben használhatnak fel!

PCR

A standard PCR-hez csak egy DNS-polimerázra, magnéziumra, nukleotidokra, primerekre, az amplifikálandó DNS-templátra és egy termociklerre van szüksége.A PCR-mechanizmus éppoly egyszerű, mint a célja: 1) a kétszálú DNS-t (dsDNS) hővel denaturálják, 2) a primerek az egyes DNS-szálakhoz igazodnak, és 3) a primereket DNS-polimeráz meghosszabbítja, így a DNS-ből két kópia keletkezik. eredeti DNS-szál.A denaturációs, lágyítási és nyúlási folyamatot egy sor hőmérsékleten és időn keresztül egy amplifikációs ciklusnak nevezzük (1. ábra).

A ciklus minden lépését a használt sablonhoz és primerkészlethez kell optimalizálni.Ezt a ciklust körülbelül 20-40-szer megismételjük, majd az amplifikált terméket elemezhetjük, jellemzően agaróz géllel (2. ábra).

Mivel a PCR rendkívül érzékeny módszer, és az egyes reakciókhoz nagyon kis térfogatok szükségesek, több reakcióhoz javasolt a master mix elkészítése.A mesterkeveréket jól össze kell keverni, majd a reakciók számával fel kell osztani, biztosítva, hogy minden reakció azonos mennyiségű enzimet, dNTP-ket és primereket tartalmazzon.Számos beszállító, például az Enzo Life Sciences is kínál PCR-keverékeket, amelyek már mindent tartalmaznak, kivéve a primereket és a DNS-templátot.

A guaninban/citozinban gazdag (GC-ben gazdag) régiók kihívást jelentenek a standard PCR technikákban.A GC-ben gazdag szekvenciák stabilabbak, mint az alacsonyabb GC-tartalmú szekvenciák.Ezenkívül a GC-ben gazdag szekvenciák hajlamosak másodlagos struktúrákat, például hajtűhurkokat képezni.Ennek eredményeként a GC-ben gazdag kettős szálakat nehéz teljesen szétválasztani a denaturációs fázisban.Következésképpen a DNS-polimeráz nem tudja akadály nélkül szintetizálni az új szálat.A magasabb denaturációs hőmérséklet javíthatja ezt, és a magasabb hőkezelési hőmérséklet és a rövidebb lágyítási idő felé történő beállítás megakadályozhatja a GC-ben gazdag primerek nem specifikus kötődését.További reagensek fokozhatják a GC-ben gazdag szekvenciák amplifikációját.A DMSO, a glicerin és a betain elősegítik a GC kölcsönhatások által okozott másodlagos struktúrák felbomlását, és ezáltal elősegítik a kettős szálak szétválását.

Hot Start PCR

A nem specifikus amplifikáció olyan probléma, amely a PCR során előfordulhat.A legtöbb PCR-hez használt DNS-polimeráz 68 °C és 72 °C közötti hőmérsékleten működik a legjobban.Az enzim azonban alacsonyabb hőmérsékleten is aktív lehet, bár kisebb mértékben.Az összekapcsolási hőmérséklet alatti hőmérsékleten a primerek nem specifikusan kötődhetnek, és nem specifikus amplifikációhoz vezethetnek, még akkor is, ha a reakciót jégen hajtják végre.Ez megelőzhető olyan polimeráz-inhibitorok alkalmazásával, amelyek csak egy bizonyos hőmérséklet elérésekor disszociálnak a DNS-polimerázból, innen ered a hot start PCR kifejezés.Az inhibitor lehet egy antitest, amely megköti a polimerázt, és a kezdeti denaturálási hőmérsékleten (általában 95 °C) denaturálódik.

High Fidelity polimeráz

Míg a DNS-polimerázok meglehetősen pontosan amplifikálódnak az eredeti templát szekvenciához, hibák előfordulhatnak a nukleotid-illesztésben.Az alkalmazásokban, például a klónozásban tapasztalható eltérések csonkolt transzkriptumokat és hibásan lefordított vagy inaktív fehérjéket eredményezhetnek.Ezen eltérések elkerülése érdekében „lektori” tevékenységgel rendelkező polimerázokat azonosítottunk és beépítettünk a munkafolyamatba.Az első lektoráló polimerázt, a Pfu-t 1991-ben azonosították Pyrococcus furiosusban.Ez a Pfu enzim 3'-5' exonukleáz aktivitással rendelkezik.Ahogy a DNS amplifikálódik, az exonukleáz eltávolítja a nem illeszkedő nukleotidokat a szál 3' végén.Ezután a megfelelő nukleotidot kicserélik, és a DNS-szintézis folytatódik.A helytelen nukleotidszekvenciák azonosítása a megfelelő nukleozid-trifoszfát enzimhez való kötődési affinitásán alapul, ahol a nem hatékony kötődés lassítja a szintézist, és lehetővé teszi a megfelelő pótlást.A Pfu polimeráz lektori aktivitása kevesebb hibát eredményez a végső szekvenciában a Taq DNS polimerázhoz képest.Az elmúlt években más lektori enzimeket azonosítottak, és az eredeti Pfu enzimet módosították, hogy tovább csökkentsék a hibaarányt a DNS-amplifikáció során.

RT-PCR

A reverz transzkripciós PCR vagy RT-PCR lehetővé teszi az RNS templátként történő használatát.Egy további lépés lehetővé teszi az RNS kimutatását és amplifikációját.Az RNS-t reverz transzkriptáz segítségével komplementer DNS-vé (cDNS) írják át.Az RNS-templát minősége és tisztasága elengedhetetlen az RT-PCR sikeréhez.Az RT-PCR első lépése egy DNS/RNS hibrid szintézise.A reverz transzkriptáznak RNáz H funkciója is van, ami lebontja a hibrid RNS részét.Az egyszálú DNS-molekulát ezután a reverz transzkriptáz cDNS-vé történő DNS-függő DNS-polimeráz aktivitása teszi teljessé.Az első szálú reakció hatékonysága befolyásolhatja az amplifikációs folyamatot.Innentől kezdve a standard PCR eljárást használják a cDNS amplifikálására.Az RNS cDNS-vé való visszaállításának lehetősége RT-PCR-rel számos előnnyel jár, és elsősorban génexpressziós elemzésre használják.Az RNS egyszálú és nagyon instabil, ami kihívást jelent vele dolgozni.Általában első lépésként szolgál a qPCR-ben, amely számszerűsíti az RNS-transzkriptumokat egy biológiai mintában.

qPCR és RT-qPCR

A kvantitatív PCR-t (qPCR) számos alkalmazáshoz használják nukleinsavak kimutatására, jellemzésére és mennyiségi meghatározására.Az RT-qPCR-ben az RNS-transzkriptumok mennyiségét gyakran úgy határozzák meg, hogy először cDNS-be írják át őket, a fent leírtak szerint, majd ezt követően hajtják végre a qPCR-t.A standard PCR-hez hasonlóan a DNS-t három ismétlődő lépéssel amplifikálják: denaturáció, annealing és elongáció.A qPCR-ben azonban a fluoreszcens jelölés lehetővé teszi az adatok gyűjtését a PCR előrehaladtával.Ennek a technikának számos előnye van a rendelkezésre álló módszerek és kémia sokfélesége miatt.

A festékalapú qPCR-ben (jellemzően zöld) a fluoreszcens jelölés lehetővé teszi az amplifikált DNS-molekulák mennyiségi meghatározását dsDNS-kötő festék alkalmazásával.Minden ciklus során megmérjük a fluoreszcenciát.A fluoreszcencia jel arányosan növekszik a replikált DNS mennyiségével.Ezért a DNS mennyiségi meghatározása „valós időben” történik (3. ábra).A festék alapú qPCR hátránya, hogy egyszerre csak egy célpont vizsgálható, és hogy a festék a mintában lévő bármely ds-DNS-hez kötődik.

A szonda alapú qPCR során minden mintában egyszerre sok célpont detektálható, de ehhez optimalizálni és a primerek mellett használt célspecifikus szondá(ka)t is meg kell tervezni.Többféle szonda kialakítás létezik, de a leggyakoribb típus a hidrolízis szonda, amely fluorofort és kioltót tartalmaz.A fluoreszcencia rezonancia energiatranszfer (FRET) megakadályozza a fluorofor kibocsátását a kioltón keresztül, miközben a szonda sértetlen.A PCR-reakció során azonban a próba hidrolizálódik a primer kiterjesztése és a hozzá kapcsolódó specifikus szekvencia amplifikációja során.A próba hasítása elválasztja a fluorofort a kioltótól, és a fluoreszcencia amplifikációtól függő növekedését eredményezi (4. ábra).Így a próba alapú qPCR reakcióból származó fluoreszcens jel arányos a mintában jelenlévő próba célszekvencia mennyiségével.Mivel a szondán alapuló qPCR specifikusabb, mint a festékalapú qPCR, gyakran ezt a technológiát alkalmazzák a qPCR-alapú diagnosztikai vizsgálatokban.

Izotermikus erősítés

A fent említett PCR technikákhoz drága termociklusos berendezésre van szükség a kamra hőmérsékletének pontos emeléséhez és csökkentéséhez a denaturálási, lágyítási és kiterjesztési lépésekhez.Számos olyan technikát fejlesztettek ki, amelyhez nincs szükség ilyen precíz eszközökre, és egyszerű vízfürdőben vagy akár a kérdéses cellákon belül is végrehajtható.Ezeket a technikákat összefoglaló néven izoterm erősítésnek nevezik, és exponenciális, lineáris vagy kaszkáderősítésen alapulnak.

Az izoterm amplifikáció legismertebb típusa a hurok által közvetített izoterm amplifikáció vagy LAMP.A LAMP exponenciális amplifikációt alkalmaz 65 °C-on a templát DNS vagy RNS amplifikálására.A LAMP végrehajtásakor négy-hat, a cél-DNS régióival komplementer primert használnak DNS-polimerázzal az új DNS szintetizálására.E primerek közül kettő komplementer szekvenciákkal rendelkezik, amelyek felismerik a többi primer szekvenciáját, és megkötik azokat, lehetővé téve egy „hurok” struktúra kialakulását az újonnan szintetizált DNS-ben, amely azután segíti a primer összekapcsolódását a következő amplifikációs körökben.A LAMP többféle módszerrel is megjeleníthető, beleértve a fluoreszcenciát, agaróz gélelektroforézist vagy kolorimetriát.A termék jelenlétének vagy hiányának kolorimetriával történő könnyű láthatósága és kimutatása, valamint a szükséges drága berendezések hiánya miatt a LAMP megfelelő lehetőséget kínált a SARS-CoV-2 tesztelésére olyan területeken, ahol a klinikai laboratóriumi vizsgálatok nem állnak rendelkezésre, vagy a minták tárolására és szállítására. nem volt megvalósítható, vagy olyan laboratóriumokban, amelyek korábban nem rendelkeztek PCR termociklusos berendezéssel.