Szerzők: Wang Xiaoyan, Zhao Eryu

Egység: Jiaozhou Kórház, Dongfang Kórház, amely a Tongji Egyetemhez kapcsolódik

Jelenleg a légúti kórokozók nukleinsav kimutatásának fő mintatípusa a toroktampon.Sokféle általánosan használt mintatartósító megoldás létezik, amelyek mindegyikét hűteni kell vagy le kell fagyasztani a szállításhoz és tároláshoz;Nehéz ellenőrizni az egész alacsony hőmérsékleti folyamatot a gyűjtési és szállítási folyamat során, és nehéz biztosítani a minőség-ellenőrzést a mintavizsgálat előtt^[1-2].

Az RNáz (RNáz) egy endonukleáz, amely az RNS-t hidrolizálja, főként a nukleotidok közötti foszfodiészter kötéseket szakítva el.Az RNáz molekula nagyon stabil, a szerkezetében diszulfid kötések vannak, működéséhez nem szükséges kétértékű kationok jelenléte, így az RNáz nem könnyen denaturálódik, és könnyen renaturálható még magas hőmérsékleten vagy denaturálószerek használata után is.Az RNázok endogén és exogén sejtekre oszthatók.Az endogén RNázok felszabadulhatnak a sejtek felszakadásával egy időben.Ezért az endogén RNázok szerepének megszüntetése nagyon kritikus lépés az RNS extrakciós folyamatában.Az exogén RNázok széles körben elterjedtek.Az RNázok megtalálhatók a levegőben, az emberi bőrben, a hajban és a nyálban, amelyek fontos okai az RNS könnyű lebomlásának^[3].

Adatlekérdezés

A CANS-CL02-A009 „Orvosi laboratóriumi minőségi és kompetencia akkreditációs irányelvek alkalmazása a molekuláris diagnosztika területén” a műszaki követelményekben javasolja, hogy a kérelemnek megfelelően megfelelő vízminőségi előírásokat kell megfogalmazni;Eldobható légmentesen záródó edények:

RNase/Osztályozás

(1) RNáz A

A ribonukleáz A (RNáz A), amely a szarvasmarha hasnyálmirigyéből származik, egy endoribonukleáz, amely specifikusan képes megtámadni az RNS pirimidin-maradékainak 3'-végét, levágva a szomszédos nukleotidok által képződött citozint vagy uracilt.Foszfodiészter kötés, a reakció végterméke egy 3'-pirimidin-nukleotid és egy oligonukleotid, amelynek végén egy 3'-pirimidin-nukleotid.

(2) RNáz T1

A ribonukleáz T1 (RNáz T1) az Aspergillus orjzae-ből származik, specifikusan a guanin 3'-terminális foszfátjára hat, és a hasítási hely a guanin 3'-foszfátja és a szomszédos nukleotidok 5'-hidroxilcsoportja között található.A reakció végterméke 3'-guanilsav és oligonukleotid-fragmensek 3'-guanilsavval a végén.

(3) RNáz H

A ribonukleáz H-t (RNáz H) először a borjú csecsemőmirigy-szövetéből fedezték fel, és kódoló génjét Escherichia coliba klónozták.Kifejezetten képes lebontani a DNS-t: RNS szálakat RNS hibrid duplexekben, így 3′-OH és 5′-monofoszfát végű oligonukleotidokat és mononukleotidokat eredményez, egy- vagy kétszálú DNS-t vagy RNS-t nem képes lebontani.

RNáz

Funkció és használat

A ribonukleáz képes katalizálni a ribonukleinsav (RNS) lebomlását, és mesterségesen szintetizálható.A gyógyászati ​​kenőcsöt helyileg alkalmazzák traumák és ízületi fájdalmak kezelésére.A jelentések szerint a ribonukleáz megváltoztathatja a gazdasejt anyagcseréjét, gátolja a vírusszintézist, gátolja az influenzavírus in vitro proliferációját, valamint gátolja a vakcina és a herpeszvírus kialakulását csirkeembriókban.A ribonukleáz napi 180 mg-os intramuszkuláris injekciójának klinikai alkalmazása, amely előnyös a járványos agyvelőgyulladás kezelésében, a ribonukleáz katalizálhatja a ribonukleinsav (RNS) lebomlását, és ma már mesterségesen szintetizálható.A gyógyászati ​​kenőcsöt helyileg alkalmazzák traumák és ízületi fájdalmak kezelésére.A jelentések szerint a ribonukleáz megváltoztathatja a gazdasejt anyagcseréjét, gátolja a vírusszintézist, gátolja az influenzavírus in vitro proliferációját, valamint gátolja a vakcina és a herpeszvírus kialakulását csirkeembriókban.A ribonukleáz napi 180 mg intramuszkuláris injekció klinikai alkalmazása előnyös a járványos agyvelőgyulladás kezelésében.

RNáz

Inhibitor meghatározása

Az RNáz inhibitor egység meghatározása: Az 5ng RNáz A aktivitásának 50%-ának gátlásához szükséges enzim mennyisége egy egység.

Hogyan működnek az RNáz-gátlók

Guanidin-izotiocianát:

A guanidin-izotiocianát egy C2H6N4S molekulaképletű szerves vegyület.Főleg biológiai gyógyászatban, kémiai reagensekben stb. használják. A guanidin-izotiocianát fehérje lizáló szer, és gyakran használják a lízisoldat fő összetevőjeként molekuláris diagnosztikai reagensekben.Képes lizálni a szöveteket, elpusztítani a sejtszerkezetet, leválasztani a nukleinsavat a nukleoproteinről, és erősen denaturálódik RNázzá.Jelenleg ez a leghatékonyabb RNáz inhibitor.

A TRIzol egy új teljes RNS extrakciós reagens, amely közvetlenül képes a teljes RNS-t kivonni sejtekből vagy szövetekből.Olyan anyagokat tartalmaz, mint a fenol és a guanidin-izotiocianát, amelyek gyorsan tönkretehetik a sejteket és gátolhatják a sejtek által felszabaduló nukleázokat.

(A guanidin-izotiocianát azonban veszélyes a laboratóriumi kutatók egészségére.)

RNazin:

Patkánymájból vagy emberi blastodermából kivont savas glikoprotein.Az Rnazin az RNáz nem kompetitív inhibitora, amely különféle RNázokhoz kötődve inaktiválja azokat.

(További részletek: https://www.foreivd.com/foreasy-rnase-inhibitor-product/)

Hmagas hőmérséklet:

A magas hőmérséklet a fehérjedenaturáció gyakori módja is.

Dietil-pirokarbonát (DEPC):

A DEPC egy erős, de hiányos RNáz inhibitor, amely az RNáz aktív csoportjának aminosav imidazol gyűrűjével kombinálva képes gátolni az RNáz aktivitást a fehérjék denaturálására.

Vanadil ribonukleozid komplex:

Vanádium-oxid ionok és nukleozidok alkotta komplex, amely átmeneti anyagok formájában kötődik az RNázhoz, ami szinte teljesen gátolja az RNáz aktivitását

Egyéb:

Az SDS, a karbamid, a kovaföld stb. szintén bizonyos gátló hatással bírnak az RNázra.

Szakértői vélemények

Li Yujie vezető technikus

A Tongji Egyetemhez kapcsolódó Dongfang Kórház Jiaozhou Kórház Laboratóriumi Osztályának igazgatója

Az exogén RNáz biológiai lebomlásának megakadályozása érdekében maszkot, kesztyűt és sapkát kell viselni és gyakran cserélni az RNS extrakciós folyamata során.Minden üvegedényt szárítószekrényben 200°C-on 2 óránál tovább kell sütni.A sütéshez használt anyagokat, például a műanyagot DEPC vízzel kell kezelni, majd desztillált vízzel le kell mosni.Az RNS extrakciójára, tartósítására és azonosítására használt reagenseket vagy eszközöket az RNS-nek kell szentelni, és önálló RNS-műveleti területet kell kialakítani.

referenciák:

[1] Smith-Vaughan HC, Binks MJ, Beissbarth J, et al.Baktériumok és vírusok a nasopharynxben közvetlenül az akut alsó légúti fertőzések megjelenése előtt őslakos ausztrál gyermekeknél [J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2018, 37 (9): 1785-1794.

[2] A Kínai Megelőző Orvostudományi Szövetség Kórházi Fertőzés-ellenőrző részlege.Útmutató a klinikai mikrobiális minták gyűjtéséhez és vizsgálatához [J].Chinese Journal of Hospital Infection, 2018(20):3192-3200.

[3] „Clinical Test Ten Thousand Why Molecular Biology Test Volume”