A formális kísérletek zökkenőmentes lefolytatásának előfeltétele a primerek és próbák teljesítményének ellenőrzése a PCR reagensek korai szakaszában, és a legmegfelelőbb reakciókörülmények meghatározása.
Tehát hogyan kell megerősítenünk a primer szondát a korai szakaszban?
A fő indikátorok az alapvonal, az amplifikációs görbe, a ct érték, az amplifikációs hatékonyság, az alacsony koncentrációjú minta kimutatása, a CV stb.
Alapvonal
Az alapvonal a PCR amplifikációs görbe vízszintes vonala.A PCR amplifikációs reakció első néhány ciklusában a fluoreszcencia jel nem sokat változik, és egyenes vonalat alkot.Ez az egyenes vonal az alapvonal.
A PCR primer próbák szűrésekor ügyeljen arra, hogy az alapvonal szintben van-e.A primer szonda koncentrációjának tisztasága befolyásolja az alapvonalat, például az alapvonal emelkedését vagy csökkenését okozza.Az alapvonal is nagyon intuitív mutató.
Erősítési görbe
Egy másik intuitív mutató az erősítési görbe alakja.A legjobb, ha S-alakú görbét használunk, hogy elkerüljük a másodlagos erősítést vagy más abnormális erősítési görbéket.
Ct érték
Az alapvonaltól az exponenciális növekedésig tartó inflexiós pontnak megfelelő ciklusok száma a Ct érték.
Ugyanazon mintánál a különböző primer próbák eltérő amplifikációs görbéket eredményeznek, és a megfelelő Ct értéket befolyásolja az amplifikáció hatékonysága és az interferencia mértéke.Elméletileg minél kisebb a választott primer szonda Ct értéke, annál jobb.
Erősítési Hatékonyság
A PCR amplifikáció hatékonyságának értékelésére az egyik legmegbízhatóbb és legstabilabb módszer a kutatók által is széles körben elismert standard görbe.A módszer magában foglalja egy sor minta készítését a célsablonok relatív számának szabályozására.Ezeket a mintákat általában tömény törzsoldatok sorozathígításával készítik, leggyakrabban a 10-szeres hígítást alkalmazzák.Hígított minták sorozatát használva, szabványos qPCR programmal amplifikálva a Cq értéket kapjuk, végül az egyes minták koncentrációjának és a megfelelő Cq értéknek megfelelő standard görbét húzva megkapjuk a Cq= -klgX0+b lineáris egyenletet, és az amplifikációs hatásfok E=10(-1 /k)-1.Ha kvantitatív analízishez qPCR-t használunk, az amplifikációs hatékonyságnak 90%-110% tartományban kell lennie (3,6>k>3,1).
Alacsony koncentrációjú minták észlelése
Ha a minta koncentrációja alacsony, a különböző primer próbák kimutatási sebessége eltérő.20 alacsony koncentrációjú mintát választunk ki replikációra, és a legmagasabb kimutatási arányú primer-szonda rendszer a legjobb.
Variációs együttható (CV)
10 párhuzamos minta detektálható különböző primer próbákkal a nukleinsavamplifikáció kimutatására szolgáló reagens vonalstandardja szerint.
Kvantitatív reagensek:
Pontosság
Az egy tételen belüli pontosságnak meg kell felelnie: a vizsgálati koncentráció logaritmikus értékének variációs együtthatója (CV,%) ≤5%.Ha a minta koncentrációja alacsony, a kimutatási koncentráció logaritmusának variációs együtthatója (CV,%) ≤10%
Minőségi reagensek:
Pontosság
Az egy tételen belüli pontosságnak meg kell felelnie:
(1) A Ct-érték variációs együtthatója (CV,%) ≤5%
Ugyanazt a mintát párhuzamosan 10 alkalommal tesztelik, és a vizsgálati eredményeknek konzisztenseknek kell lenniük
Feladás időpontja: 2021.09.18
