Úgy gondolom, hogy a PCR-reakciók során mindenki találkozik ilyen-olyan problémákkal, de ezek többsége két fő problémakörbe sorolható:

A gén templát túl kevés amplifikációja (amplifikáció);
Túl sok nem célgén amplifikáció.
Az adalékanyagok használata az egyik általános stratégia e problémák megoldására.Az adalékanyagok szerepének általában két aspektusa van:
másodlagos szerkezetgének (másodlagos szerkezet);
Csökkentse a nem specifikus alapozást.
Ma a szerkesztő röviden bemutatja Önnek a PCR-reakciókban szokásos adalékanyagokat és azok funkcióit.
A másodlagos szerkezetet csökkentő adalékok
szulfoxid(DMSO)
génmintákmagas GC tartalommal.A DMSO azonban nagymértékben csökkenti a Taq polimeráz aktivitást is.Ezért mindenkinek egyensúlyban kell lennie a templát hozzáférhetősége és a polimeráz aktivitása között.A szerkesztő azt javasolja, hogy próbálja ki a DSMO különböző koncentrációit, például 2% és 10% között, hogy megtalálja a kísérletének megfelelő koncentrációt.
Nem ionos mosószerek
A nemionos detergensek, mint például a 0,1-1% Triton X-100, Tween 20 vagy NP-40, általában csökkentik a DNS másodlagos szerkezetét.Ez ugyan növelheti a templátgén amplifikációját, de a nem specifikus amplifikáció problémáját is okozza.Tehát ezek az adalékok jól működnek az alacsony hozamú, törmelék nélküli PCR-reakciókban, de nem olyan jól a viszonylag szennyezett PRC-reakciókban.A nemionos mosószerek másik előnye az SDS szennyeződés csökkentése.Általában a DNS-kivonási folyamat során az SDS-t a PCR-lépéshez vezetik, ami nagymértékben gátolja a polimeráz aktivitását.Ezért 0,5% Tween-20 vagy Tween-40 hozzáadása a reakcióhoz semlegesítheti az SDS negatív hatásait.
Betain_
A betain javíthatja a DNS-amplifikációt azáltal, hogy csökkenti a másodlagos struktúra kialakulását, és általában „rejtélyes” kiegészítője a kereskedelmi PCR-készleteknek.Ha betaint szeretne használni, betaint vagy betain-monohidrátot (Betain vagy Betain-monohidrát) kell tennie, de betain-hidrokloridot (Betain HCl) nem, 1-1,7 M végső koncentrációra állítsa be.A betain segíthet a specifitás javításában is, mivel kiküszöböli a DNS olvadás/DNS denaturáció bázispár összetételtől való függését.
Adalékok a nem specifikus alapozás csökkentésére
formamid
A formamid egy gyakran használt szerves PCR adalék.Kombinálható a DNS-ben található nagyobb és kisebb barázdákkal, ezáltal csökkentve a mester-DNS kettős hélix stabilitását és csökkentve a DNS olvadáspontját.A PCR-kísérletekben használt formamid koncentrációja általában 1%-5%.
Tetrametilammónium-klorid( TMAC)
A tetrametilammónium-klorid növelheti a hibridizáció specifitását (hibridizációs specificitás) és növelheti a DNS olvadáspontját.Így a TMAC képes eltávolítani a nem specifikus beindítást és csökkenteni a DNS és az RNS hibás kötődését.Ha használdegenerált primerekA PCR-reakcióban ne felejtse el hozzáadni a TMAC-ot, amelyet általában 15-100 mM koncentrációban használnak.
Egyéb gyakori adalékok
Az adalékanyagok fent említett két kategóriája mellett a PCR-reakciókban számos gyakori adalék van, bár ezeknek különböző funkciójuk van, de szintén nagyon fontosak.
Magnézium ion
A magnéziumion a polimeráz nélkülözhetetlen kofaktora (kofaktora), vagyis magnéziumion nélkül a polimeráz inaktív.A túl sok magnéziumion azonban befolyásolhatja a polimeráz hatékonyságát is.A magnéziumionok koncentrációja az egyes PCR-reakciókban változik.A kelátképző szerek (például EDTA vagy citrát), a dNTP-k és a fehérjék koncentrációja mind befolyásolják a magnéziumionok koncentrációját.Tehát, ha problémái vannak a PCR-kísérletével, megpróbálhatja megváltoztatni a különböző magnéziumion-koncentrációkat, például 1,0-ról 4,0 mM-ra, 0,5–1 mM-es intervallumokkal.
Érdemes megjegyezni, hogy a többszöri fagyasztás-olvadás ciklus a magnézium-klorid oldat koncentrációs rétegződéséhez vezethet.Ezért minden használat előtt teljesen fel kell oldani, és használat előtt alaposan össze kell keverni.
Szarvasmarha szérum albumin(Szarvasmarha albumin, BSA)
A molekuláris kémiai kísérletekben a szarvasmarha-szérumalbumin nagyon gyakori adalékanyag, különösen a restrikciós enzimes emésztésben és a PCR-kísérletekben.A PCR-reakciókban a BSA segít a szennyeződések, például a fenolos vegyületek csökkentésében.És azt is mondják, hogy csökkentheti a reagensek tapadását a kémcső falához.A PCR reakcióban a hozzáadott BSA koncentrációja általában elérheti a 0,8 mg/ml-t.
 
Kapcsolódó termékek:
PCR hős(festékkel)
PCR hős