A közvetlen PCR olyan reakció, amely közvetlenül állati vagy növényi szöveteket használ fel az amplifikációhoz nukleinsav extrakció nélkül.A közvetlen PCR sok szempontból úgy működik, mint a szokásos PCR

A fő különbség a direkt PCR-ben alkalmazott egyedi puffer, a minta nukleinsav extrakció nélkül közvetlenül is alávethető a PCR-reakciónak, de ennek megfelelő követelmények vonatkoznak az enzimek toleranciájára és a direkt PCR-reakcióban résztvevő puffer kompatibilitására.

Bár a gyakori mintákban több-kevesebb PCR-inhibitor található, a közvetlen PCR-rel mégis megbízható amplifikáció érhető el enzimek és pufferek hatására.A hagyományos PCR reakcióhoz kiváló minőségű nukleinsav szükséges templátként, amely gátolja a PCR reakció zökkenőmentes lefolyását, ha a templát fehérjéket és egyéb szennyeződéseket tartalmaz.A közvetlen PCR jelenleg az egyik legnépszerűbb technológia a molekuláris diagnosztika területén.

01 A közvetlen PCR-t eredetileg állatokra és növényekre használták

A direkt PCR-t legkorábban az állatok és növények területén alkalmazzák, például patkányok, macska, csirke, nyúl, birka, szarvasmarha vére, szövetei és szőrei, növényi levelek és magvak stb., amelyeket genotipizálás, transzgenikus, plazmid-detektálás, génkiütési analízis, DNS-forrás azonosítás, fajok azonosítása, SNP-elemzés és más területek vizsgálatára használnak.

Ezeknek a mezőknek van néhány közös jellemzője, vagyis a célgéntartalom viszonylag magas, a nukleinsav kivonása pedig problémás, így a direkt PCR nem csak időt takaríthat meg, és kis mértékben befolyásolhatja az eredményeket, de költséget is megtakaríthat.

A kórokozók kimutatására használt közvetlen PCR az elmúlt évek kérdése, egyes PCR reagensgyártók sok erőfeszítést tettek ebbe az irányba az innováció során.Különösen ebben a COVID-19 járványban sok ilyen kimutatási termék jelent meg a piacon, mint például a Foregene által kutatott és kifejlesztett SARS-CoV-2 Nucleic Acid Detection Kit (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method), amely valós idejű RT PCR technológiát (rRT-PCR) használ a SARS-2 nucleic-CoV-2 nukleinsav kimutatására. tampont minták.

A Foregene azon vállalatok közé tartozik, amelyek Direct PCR technológiát használnak a normál ORF1ab, N, E ésváltozat emberi nasopharyngealis vagy oropharyngealis tamponmintákban található nukleinsavak, mint például a SARS-CoV-2 B.1.1.7 (UK), B.1.351 (ZA), B.1.617 (IND) és P.1 törzs (BR).

02  A közvetlen PCR-hez szükséges reagensek

Lizátum minta

A minta lizátumot saját maga konfigurálhatja vagy megvásárolhatja.A különböző márkájú lizátumok összetételének különbsége miatt a lízis képessége eltérő lesz, majd a lízis ideje kissé eltérő lesz.Például állati szövetminták készítéséhez általában 30 perces vagy egy éjszakán át végzett lízis javasolt, a vírusok lízisoldata pedig 3-10 perc.

PCR master mix

A specifikus amplifikáció fokozása és az amplifikációs képesség növelése érdekében a hot-start DNS polimeráz használata javasolt.A közvetlen PCR magja egy nagyon toleráns polimeráz.

Távolítsa el vagy gátolja a DNS-amplifikációt befolyásoló komponenseket a mintában

A minta lizátummal való feldolgozása után fehérjék, lipidek és egyéb sejttörmelékek szabadulnak fel, ezek az anyagok gátolják a PCR-reakciót.Ezért a közvetlen PCR-hez megfelelő eltávolítást vagy inhibitorokat kell hozzáadni e tényezők hatásának csökkentése érdekében.

03  A közvetlen PCR öt tudáspontjának gyűjteménye

Először is, a Direct PCR technológia egy közvetlen PCR technológia különféle biológiai mintákhoz.Ilyen műszaki feltételek mellett nincs szükség a nukleinsav szétválasztására és extrahálására, a szövetminta közvetlen felhasználására tárgyként, és a célgén primerek hozzáadására a PCR-reakció végrehajtásához.

Másodszor, a közvetlen PCR technológia nem csupán egy hagyományos DNS-templát-amplifikációs technológia, hanem magában foglalja az RNS-templát reverz transzkripciós PCR-t is.

Harmadszor, a Direct PCR technológia nemcsak közvetlenül hajt végre rutin kvalitatív PCR-reakciókat szövetmintákon, hanem magában foglalja a valós idejű qPCR reakciókat is, amelyek megkövetelik, hogy a reakciórendszer erős háttér fluoreszcencia-interferenciát gátló képességgel rendelkezzen, és az endogén fluoreszcencia kioltja az antagonista képességet.

Negyedszer, a Direct PCR technológiával megcélzott mintáknak csak nukleinsav templátok felszabadítására van szükségük, és nem távolítják el a PCR reakciót zavaró fehérjéket, poliszacharidokat, sóionokat stb.Ami megköveteli, hogy a reakciórendszerben a nukleinsav polimeráz és a PCR Mix kiváló rezisztenciával és alkalmazkodóképességgel rendelkezzen az enzimaktivitás és a replikációs pontosság biztosítása érdekében összetett körülmények között.

Ötödször, a Direct PCR technológiával megcélzott szövetminta nukleinsavas dúsító kezelés nélkül és a templát mennyisége nagyon kicsi, ami a reakciórendszertől rendkívül magas érzékenységet és amplifikációs hatékonyságot igényel.