A molekuláris diagnosztikai technológia molekuláris biológiai módszereket alkalmaz az emberi szervezet genetikai anyagának és a különféle kórokozók kifejeződésének és szerkezetének kimutatására, hogy elérje a betegségek előrejelzését és diagnosztizálását.

Az elmúlt években a molekuláris diagnosztikai technológia korszerűsítésével és iterációjával a molekuláris diagnosztika klinikai alkalmazása egyre kiterjedtebbé és elmélyültebbé vált, a molekuláris diagnosztikai piac pedig a gyors fejlődés időszakába lépett.

A szerző összefoglalja a piacon elterjedt molekuláris diagnosztikai technológiákat, és három részre tagolódik: az első rész a PCR technológiát, a második a nukleinsav izoterm amplifikációs technológiát, a második rész pedig a szekvenálási technológiát mutatja be.

01

I. rész: PCR technológia

PCR technológia

A PCR (polimeráz láncreakció) az egyik in vitro DNS-amplifikációs technológia, több mint 30 éves múltra tekint vissza.

A PCR technológia úttörője volt 1983-ban, Kary Mullis, a Cetus, USA.Mullis 1985-ben PCR-szabadalmat kért, és ugyanebben az évben publikálta az első tudományos tudományos közleményt a PCR-ről.Mullis 1993-ban elnyerte a kémiai Nobel-díjat.

A PCR alapelvei

A PCR több mint egymilliószorosára képes amplifikálni a cél DNS-fragmenseket.Az alapelv az, hogy a DNS-polimeráz katalízise során a kiindulási DNS-szálat használják templátként, és egy specifikus primert használnak a kiterjesztéshez.In vitro replikálódik olyan lépéseken keresztül, mint a denaturáció, a lágyítás és az extenzió.Az anyaszál templát DNS-sel komplementer leányszálú DNS folyamata.

A standard PCR folyamat három lépésből áll:

1. Denaturálás: Magas hőmérsékletet használjon a DNS kettős szálak elválasztására.A DNS kettős szálai közötti hidrogénkötések magas hőmérsékleten (93-98°C) felszakadnak.

2. Légzés: A kétszálú DNS szétválasztása után a hőmérsékletet lecsökkentjük, hogy a primer kötődhessen az egyszálú DNS-hez.

3. Extenzió: A DNS-polimeráz a hőmérséklet csökkentésével komplementer szálakat kezd szintetizálni a DNS-szálak mentén a megkötött primerekből.Amikor a kiterjesztés befejeződött, egy ciklus befejeződik, és a DNS-fragmensek száma megduplázódik.

Ha ezt a három lépést 25-35-ször viszonozza, a DNS-fragmensek száma exponenciálisan megnő.

A PCR ötletessége, hogy a különböző célgénekhez különböző primereket lehet tervezni, így a célgén fragmentumok rövid időn belül amplifikálhatók.

A PCR eddig három kategóriába sorolható, nevezetesen a közönséges PCR-re, a fluoreszcens kvantitatív PCR-re és a digitális PCR-re.

A közönséges PCR első generációja

Használjon közönséges PCR amplifikációs műszert a célgén amplifikálásához, majd agaróz gélelektroforézist alkalmazzon a termék kimutatására, csak kvalitatív elemzés végezhető.

Az első generációs PCR fő hátrányai:

- Hajlamos a nem specifikus amplifikációra és hamis pozitív eredményekre.

-Az észlelés sokáig tart, a művelet pedig nehézkes.

- Csak minőségi vizsgálat végezhető.

Második generációs fluoreszcens kvantitatív PCR

A fluoreszcens kvantitatív PCR (Real-Time PCR), más néven qPCR, a fluoreszcens jelek felhalmozódásán keresztül az amplifikált termékek felhalmozódásának nyomon követésére szolgál fluoreszcens szondák hozzáadásával, amelyek jelezhetik a reakciórendszer előrehaladását, és az eredményeket a fluoreszcencia görbén keresztül ítélik meg, valamint a Cq érték és a standard görbe segítségével.

Mivel a qPCR technológia zárt rendszerben valósul meg, így a szennyeződés valószínűsége csökken, a fluoreszcencia jel kvantitatív kimutatás céljából követhető, így a klinikai gyakorlatban a legszélesebb körben alkalmazott és a PCR domináns technológiájává vált.

A valós idejű fluoreszcens kvantitatív PCR-ben használt fluoreszcens anyagok a következőkre oszthatók: TaqMan fluoreszcens szondák, molekuláris jelzőfények és fluoreszcens festékek.

1) TaqMan fluoreszcens szonda:

A PCR-amplifikáció során egy specifikus fluoreszcens próbát adunk hozzá, miközben egy pár primert adunk hozzá.A próba egy oligonukleotid, és a két vége egy riporter fluoreszcens csoporttal és egy kioltó fluoreszcens csoporttal van megjelölve.

Amikor a próba sértetlen, a riportercsoport által kibocsátott fluoreszcens jelet a kioltó csoport elnyeli;A PCR amplifikáció során a Taq enzim 5'-3' exonukleáz aktivitása hasítja és lebontja a próbát, így a riporter fluoreszcens csoport és kioltó A fluoreszcens csoport szétválik, így a fluoreszcencia monitorozó rendszer képes fogadni a fluoreszcencia jelet, vagyis minden alkalommal, amikor egy DNS-szál fluoreszcens, a szál fluoreszcenciája és a szál fluoreszcenciája megtörténik. teljesen szinkronban van a PCR-termék képződésével.

2) SYBR fluoreszcens festékek:

A PCR reakciórendszerben feleslegben SYBR fluoreszcens festéket adnak hozzá.Miután a SYBR fluoreszcens festék nem specifikusan beépült a DNS kettős szálba, fluoreszcens jelet bocsát ki.A láncba nem beépült SYBR festékmolekula nem bocsát ki fluoreszcens jelet, ezzel biztosítva a fluoreszcens jelet. A PCR termékek növekedése teljes mértékben szinkronban van a PCR termékek növekedésével.A SYBR csak kétszálú DNS-hez kötődik, így az olvadási görbe alapján megállapítható, hogy a PCR reakció specifikus-e.

3) Molekuláris jelzőfények

Ez egy szárhurok kettős jelölésű oligonukleotid próba, amely körülbelül 8 bázisból álló hajtűszerkezetet alkot az 5. és 3. végén.A nukleinsavszekvenciák mindkét végén komplementeren párosulnak, ami a fluoreszcens csoportot és a kioltócsoportot szorossá teszi.Zárja be, nem fog fluoreszkálni.

A PCR-termék előállítása után az annealing folyamat során a molekuláris beacon középső részét egy specifikus DNS-szekvenciával párosítják, és a fluoreszcens gént elválasztják a kioltó géntől, hogy fluoreszcenciát hozzon létre.

A második generációs PCR fő hátrányai:

Az érzékenység továbbra is hiányzik, és az alacsony példányszámú minták észlelése sem pontos.

Van háttérbefolyás, és az eredmény érzékeny az interferenciára.

Harmadik generációs digitális PCR

A digitális PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) a végpont-detektáláson keresztül kiszámítja a célszekvencia kópiaszámát, és pontos abszolút kvantitatív kimutatást tud végezni belső kontrollok és standard görbék használata nélkül.

A digitális PCR végpont-detektálást használ, és nem függ a Ct-értéktől (ciklusküszöb), így a digitális PCR reakciót kevésbé befolyásolja az amplifikációs hatékonyság, és javul a PCR-reakció-gátlókkal szembeni tolerancia, nagy pontossággal és reprodukálhatósággal.

A nagy érzékenység és a nagy pontosság miatt a PCR-reakciót gátló szerek nem zavarják könnyen, és standard termékek nélkül is valódi abszolút kvantifikációt tud elérni, amely kutatási és alkalmazási hotspottá vált.

A reakcióegység különböző formái szerint három típusra osztható: mikrofluidikus, chip- és csepprendszerre.