A halláskárosodás (HL) a leggyakoribb érzékszervi fogyatékos betegség az emberekben.A fejlett országokban a gyermekek nyelv előtti süketségi eseteinek mintegy 80%-át genetikai tényezők okozzák.A leggyakoribbak az egygénes hibák (ahogy az 1. ábrán látható), 124 génmutációról derült ki, hogy emberben nem szindrómás halláskárosodáshoz köthető, a többit környezeti tényezők okozzák.A cochlearis implantátum (a belső fülbe helyezett elektronikus eszköz, amely közvetlenül a hallóideg elektromos stimulációját biztosítja) messze a leghatékonyabb megoldás a súlyos HL kezelésére, míg a hallókészülék (egy külső elektronikus eszköz, amely átalakítja és felerősíti a hanghullámokat) segíthet a közepesen súlyos HL-ben szenvedő betegeknek.Jelenleg azonban nem állnak rendelkezésre gyógyszerek az örökletes HL (GHL) kezelésére.Az elmúlt években a génterápia egyre nagyobb figyelmet kapott, mint ígéretes megközelítés a belső fül diszfunkció kezelésében.

1. ábra.A süketséggel összefüggő variációs típusok megoszlása.[1]

A Salk Institute és a Sheffieldi Egyetem tudósai a közelmúltban publikáltak egy kutatási eredményt a Molecular Therapy – Methods & Clinical Development [2] címmel, amely széles körű alkalmazási lehetőségeket mutatott az örökletes süketség in vivo génterápiájában.Uri Manor, a Salk Institute kutatási adjunktusa és a Waitt Center for Advanced Biophotonics igazgatója elmondta, hogy súlyos halláskárosodással született, és úgy érezte, hogy a hallás helyreállítása csodálatos ajándék lenne.Korábbi kutatásai azt találták, hogy az Eps8 egy aktin szabályozó fehérje, aktinkötő és záró aktivitással;cochlearis szőrsejtekben az Eps8 által MYO15A-val, WHIRLIN-nel, GPSM2-vel és GNAI3-mal alkotott fehérjekomplex főleg a legtöbbben létezik. A hosszú sztereocíliák csúcsai, amelyek a MYO15A-val együtt a BAIAP2L2-t a rövidebb sztereocíliák csúcsán lokalizálják, szükségesek a hajkötegek fenntartásához.Ezért az Eps8 képes szabályozni a szőrsejtek sztereocíliáinak hosszát, ami elengedhetetlen a normál hallásműködéshez;Az Eps8 deléciója vagy mutációja rövid sztereokíliák kialakulásához vezet, amelyek nem tudják megfelelően átalakítani a hangot elektromos jelekké az agy érzékeléséhez, ami viszont süketséghez vezet..Ugyanakkor Walter Marcotti munkatárs, a Sheffieldi Egyetem professzora megállapította, hogy a szőrsejtek nem tudnak normálisan fejlődni Eps8 hiányában.Ebben a tanulmányban Manor és Marcotti összefogtak annak kivizsgálására, hogy az Eps8 hozzáadása a sztereociliáris sejtekhez visszaállíthatja-e funkciójukat, és javíthatja-e az egerek hallását.A kutatócsoport az adeno-asszociált vírus (AAV) Anc80L65 vektort használta a vad típusú EPS8-at tartalmazó kódoló szekvencia bejuttatására Eps8-/- újszülött P1-P2 egerek csigacsigájába kerek ablakú membrán injekcióval;egér cochlearis szőrsejtekben A sztereociliák funkcióját az érettségük előtt helyreállítottuk;a javító hatást pedig a képalkotó technológia és a sztereokíliák mérése jellemezte.Az eredmények azt mutatták, hogy az Eps8 növelte a sztereokíliák hosszát és helyreállította a szőrsejtek funkcióját az alacsony frekvenciájú sejtekben.Azt is megállapították, hogy idővel úgy tűnt, hogy a sejtek elvesztik a génterápia általi megmentési képességüket.Ebből az következik, hogy ezt a kezelést méhen belül kell beadni, mivel az Eps8-/- szőrsejtek az egerek születése után megérettek vagy helyrehozhatatlan károkat halmoztak fel."Az Eps8 egy olyan fehérje, amely sokféle funkcióval rendelkezik, és még mindig sok a felfedeznivaló" - mondta Manor.A jövőbeli kutatások magukban foglalják az Eps8 génterápia hatásának vizsgálatát a hallás helyreállításában a különböző fejlődési szakaszokban, valamint azt, hogy lehetséges-e meghosszabbítani a kezelési lehetőségeket.Véletlenül 2020 novemberében KarenB Avraham, az izraeli Tel Avivi Egyetem professzora az EMBO Molecular Medicine folyóiratban [3] publikálta eredményeit egy innovatív génterápiás technológiával egy ártalmatlan szintetikus adeno-asszociált AAV9-PHP vírus létrehozására.B, A Syne4-/- egerek szőrsejtjeinek génhibáját úgy javították ki, hogy a Syne4 kódoló szekvenciáját hordozó vírust fecskendeztek az egerek belső fülébe, lehetővé téve, hogy az bejusson a szőrsejtekbe, és felszabadítsa a hordozott genetikai anyagot, lehetővé téve számukra az érést és a normális működést (lásd a 2. ábrát).

2. ábra.A belső fül anatómiájának sematikus ábrázolása, a Corti-szervre és a nesprin-4 sejtfunkciójára összpontosítva.

Látható, hogy a génterápia alkalmazása az örökletes betegségek génszintű kezelésének céljának elérése érdekében bármely mutált gén beiktatásával, eltávolításával vagy korrekciójával (vagyis a betegségben bekövetkező genetikai változások szabályozásával) nagy klinikai hatást fejt ki.pályázati kilátások.A genetikailag hiányos süketség jelenlegi génterápiás módszerei a következő kategóriákba sorolhatók:

génpótlás

A génpótlás vitathatatlanul a génterápia legegyszerűbb formája, amely a hibás gén azonosításán és a gén normál vagy vad típusú másolatával való helyettesítésén alapul.Az első sikeres belsőfül génterápiás vizsgálat a vezikuláris glutamát transzporter 3 (VGLUT3) gén deléciója által okozott halláskárosodásra;Az exogén VGLUT3 túlzott expressziójának AAV1 által közvetített bejuttatása a belső fülszőrsejtekben (IHC) Tartós hallás helyreállítást, részleges szalagszinaptikus morfológiai helyreállítást és görcsös válaszokat eredményezhet [4].A fenti bevezetőben ismertetett két AAV-val szállított génpótlást tartalmazó példákban azonban fontos megjegyezni, hogy a géndeléciós örökletes halláskárosodások bizonyos típusaihoz használt egérmodellek időben eltérnek az emberekétől, és a P1 egereknél a belső fül a fejlődés érett szakaszában van.Ezzel szemben az emberek érett belső füllel születnek.Ez a különbség megakadályozza az egéreredmények lehetséges alkalmazását az emberi örökletes süketségi rendellenességek kezelésére, kivéve, ha a génterápiát érett egérfülbe juttatják.

Génszerkesztés: CRISPR/Cas9

A „génpótláshoz” képest a génszerkesztési technológia fejlődése meghozta a genetikai betegségek gyökértől való kezelésének hajnalát.Fontos, hogy a génszerkesztési módszer pótolja a hagyományos túlzott expressziós génterápiás módszerek hiányosságait, amelyek nem alkalmasak domináns örökletes süketségi betegségekre, és azt a problémát, hogy a túlzott expressziós módszer nem tart sokáig.Miután kínai kutatók az AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2 génszerkesztő rendszer segítségével specifikusan kiütötték a Myo6C442Y mutáns allélt Myo6WT/C442Y egerekből, és a kiütést követő 5 hónapon belül egerek A modell hallófunkciója helyreállt;ugyanakkor azt is megfigyelték, hogy a belső fülben a szőrsejtek túlélési aránya javult, a csillók alakja szabályossá vált, az elektrofiziológiai mutatók korrigáltak [5].Ez az első olyan tanulmány a világon, amely a CRISPR/Cas9 technológiát alkalmazza a Myo6 génmutáció által okozott örökletes süketség kezelésére, és ez az örökletes süketség kezelésére szolgáló génszerkesztési technológia fontos kutatási előrehaladása.A kezelés klinikai fordítása szilárd tudományos alapot biztosít.

Génterápiás bejuttatási módszerek

A génterápia sikeressége érdekében a csupasz DNS-molekulák hidrofilitásuk és a foszfátcsoportok negatív töltése miatt nem tudnak hatékonyan behatolni a sejtekbe, illetve a kiegészített nukleinsavmolekulák integritásának biztosítása érdekében biztonságos és hatékony módszert kell választani.A kiegészített DNS a célsejtbe vagy szövetbe kerül.Az AAV-t széles körben alkalmazzák a betegségek kezelésében szállító hordozóként, magas fertőző hatása, alacsony immunogenitása és széles tropizmusa miatt a különböző szövettípusokra.Jelenleg számos kutatási munka határozta meg az AAV különböző altípusainak tropizmusát az egér cochlea különböző sejttípusaihoz viszonyítva.Az AAV szállítási jellemzőinek sejtspecifikus promóterekkel kombinálva sejtspecifikus expressziója érhető el, ami csökkentheti az off-target hatásokat.Ezenkívül a hagyományos AAV vektorok alternatívájaként folyamatosan fejlesztenek új szintetikus AAV vektorokat, amelyek kiváló transzdukciós képességet mutatnak a belső fülben, amelyek közül az AAV2/Anc80L65 a legszélesebb körben használt.A nem vírusos bejuttatási módszerek tovább oszthatók fizikai módszerekre (mikroinjekció és elektroporáció) és kémiai módszerekre (lipid alapú, polimer alapú és arany nanorészecskék).Mindkét megközelítést alkalmazták az örökletes süketségi rendellenességek kezelésében, és különböző előnyöket és korlátokat mutattak.A génterápia vivőanyagaként szolgáló bejuttató vivőanyagon túlmenően az in vivo génbeadáshoz különböző megközelítések alkalmazhatók a különböző célsejttípusok, beadási módok és terápiás hatékonyság alapján.A belső fül bonyolult szerkezete megnehezíti a célsejtek elérését, és lassú a genomszerkesztő szerek eloszlása.A hártyás labirintus a halántékcsont csontos labirintusában található, és magában foglalja a cochlearis csatornát, a félkör alakú csatornát, az utriculát és a ballont.Viszonylagos elszigeteltsége, minimális nyirokkeringése és a vértől való elválasztása a vér-labirintus gáttal korlátozza a terápiás szerek hatékony szisztémás bejutását az újszülött egerek számára.A génterápiára alkalmas vírustiterek eléréséhez vírusvektorok közvetlen helyi injekciója szükséges a belső fülbe.Az injekció beadásának ismert módjai a következők: [6]: (1) kerek ablak membrán (RWM), (2) tracheostomia, (3) endolimfatikus vagy perilimfatikus cochleostomia, (4) kerek ablak membrán plusz Tube fenestráció (CF) (mint a 3. ábrán).

3. ábra.Génterápia belső fülbejuttatása.

Bár a génterápia terén számos előrelépés történt, a klinikai transzlációs célok alapján még több munkát kell végezni, mielőtt a génterápia a genetikai betegségekben szenvedő betegek első vonalbeli kezelési lehetőségévé válhatna, különös tekintettel a biztonságos és hatékony vektorok és bejuttatási módszerek fejlesztésére.De hiszünk abban, hogy a közeljövőben az ilyen típusú kezelések a személyre szabott terápia alappilléreivé válnak, és rendkívül pozitív hatással lesznek a genetikai rendellenességekkel küzdő emberek és családjaik életére.

A Foregene egy nagy áteresztőképességű szűrőkészletet is piacra dobott a megcélzott gének számára, amely gyors és képes reverz transzkripciót és qPCR reakciókat végrehajtani RNS extrakció nélkül.

Termék linkek

Cell Direct RT-qPCR készlet – Taqman/SYBR GREEN I

További termékinformációkért forduljon:

overseas@foregene.com