A Ct érték a fluoreszcens kvantitatív PCR legfontosabb eredményprezentációs formája.A génexpressziós különbségek vagy a génkópiaszám kiszámítására szolgál.Tehát mi az ésszerűnek tartott fluoreszcencia kvantifikáció Ct értéke?Hogyan biztosítható a Ct érték effektív tartománya?
Mi az a Ct érték?
A qPCR amplifikációs folyamat során az amplifikációs ciklusok megfelelő száma (Cycle Threshold), amikor az amplifikált termék fluoreszcencia jele eléri a beállított fluoreszcencia küszöböt.A C a ciklust, a T pedig a küszöböt jelenti.Egyszerűen fogalmazva, a Ct érték azoknak a ciklusoknak a száma, amelyek megfelelnek annak, amikor a kezdeti templát-amplifikáció elér egy bizonyos mennyiségű terméket a qPCR-ben.Az úgynevezett „bizonyos mennyiségű termék” a későbbiekben további magyarázatra kerül.
Mit csinál a Ct érték?
1. Kapcsolat az exponenciális erősítés, a sablon mennyisége és a Ct érték között
Ideális esetben a qPCR génjei exponenciális amplifikációval halmozódnak fel bizonyos számú ciklus után.Az amplifikációs ciklusok száma és a termékek mennyisége közötti kapcsolat a következő: Felerősített termék mennyisége = kezdeti sablonmennyiség × (1+En) ciklusok száma.A qPCR reakció azonban nem mindig van ideális helyzetben.Amikor az amplifikált termék mennyisége elér egy „bizonyos termékmennyiséget”, a ciklusok száma ekkor a Ct érték, és az exponenciális amplifikációs periódusban van.A Ct érték és a kezdősablon mennyisége közötti kapcsolat: A sablon Ct értéke és a sablon kezdő példányszámának logaritmusa között lineáris kapcsolat van.Minél nagyobb a kezdeti templátkoncentráció, annál kisebb a Ct-érték;minél alacsonyabb a kezdeti templátkoncentráció, annál nagyobb a Ct érték.
2.Amplifikációs görbe, fluoreszcencia küszöb és bizonyos PCR termék mennyisége
A qPCR amplifikációs termék mennyisége közvetlenül fluoreszcens jel, azaz az amplifikációs görbe formájában jelenik meg.A PCR korai szakaszában az amplifikáció ideális körülmények között zajlik, a ciklusok száma kicsi, a termék felhalmozódása kicsi, és a fluoreszcencia szintje nem különböztethető meg egyértelműen a fluoreszcencia háttértől.Ezt követően a fluoreszcencia növekszik, és exponenciális fázisba lép.A PCR-termék mennyisége egy bizonyos ponton, amikor a PCR reakció éppen az exponenciális fázisban van, kimutatható, ami „bizonyos mennyiségű termékként” használható, és ebből következtethető a templát kezdeti tartalma.Ezért egy bizonyos mennyiségű terméknek megfelelő fluoreszcens jel intenzitása a fluoreszcencia küszöb.
A PCR késői szakaszában az amplifikációs görbe már nem mutat exponenciális amplifikációt, és belép a lineáris fázisba és a plató fázisba.
3. A Ct értékek reprodukálhatósága
Amikor a PCR ciklus eléri a Ct érték ciklusszámát, akkor éppen belépett a valódi exponenciális amplifikációs periódusba.Ekkor a kis hiba nem erősödött fel, így a Ct érték reprodukálhatósága kiváló, vagyis ugyanaz a sablon különböző időpontokban, vagy különböző csövekben egyszerre erősítődik.Erősítés, a kapott Ct érték állandó.
1. Erősítési hatékonyság En
A PCR amplifikációs hatékonyság arra utal, hogy a polimeráz milyen hatékonysággal alakítja át az amplifikálandó gént amplikonná.Az amplifikációs hatékonyság, ha egy DNS-molekulát két DNS-molekulává alakítanak át, 100%.Az amplifikációs hatékonyságot általában En-ként fejezik ki.A későbbi cikkek elemzésének megkönnyítése érdekében röviden bemutatjuk azokat a tényezőket, amelyek befolyásolják az erősítési hatékonyságot.
| Befolyásoló tényezők | magyarázat | Hogyan ítéljünk? |
| A. PCR inhibitorok | 1. A templát DNS olyan anyagokat tartalmaz, amelyek gátolják a PCR reakciót, például fehérjéket vagy detergenseket.2. A reverz transzkripciót követő cDNS nagy koncentrációban tartalmaz templát RNS vagy RT reagens komponenseket, amelyek szintén gátolhatják a későbbi PCR reakciót. | 1. Hogy van-e szennyezés, az A260/A280 és A260/A230 arány mérésével vagy RNS elektroforézissel lehet megítélni.2. A cDNS egy bizonyos arány szerint hígul-e reverz transzkripció után. |
| B. Nem megfelelő alapozó kialakítás | Az alapozók nem lágyulnak hatékonyan | Ellenőrizze, hogy az alapozók nincsenek-e alapozó-dimerek vagy hajtűk, nem illeszkednek-e egymáshoz, és néha átívelnek-e az intronikus mintákon. |
| C. Nem megfelelő PCR reakcióprogram-tervezés | 1. Az alapozók nem tudnak hatékonyan lágyulni2. A DNS polimeráz elégtelen felszabadulása 3. A hosszú távú magas hőmérsékletű DNS polimeráz aktivitás csökkent | 1. A lágyítási hőmérséklet magasabb, mint a primer TM értéke2. Az elődenaturálási idő túl rövid 3. A reakcióeljárás egyes szakaszainak ideje túl hosszú |
| D. A reagensek elégtelen keverése vagy pipettázási hibák | A reakciórendszerben a PCR reakciókomponensek helyi koncentrációja túl magas vagy egyenetlen, ami a PCR amplifikáció nem exponenciális amplifikációját eredményezi. | |
| E. Amplicon hossza | Az amplikon hossza túl hosszú, meghaladja a 300 bp-t, és az erősítési hatékonyság alacsony | Ellenőrizze, hogy az amplikon hossza 80-300 bp között van |
| F. A qPCR reagensek hatása | A reagensben a DNS polimeráz koncentrációja alacsony, vagy a pufferben az ionok koncentrációja nincs optimalizálva, ami azt eredményezi, hogy a Taq enzimaktivitás nem éri el a maximumot | Az erősítési hatásfok meghatározása standard görbével |
2.Ct értékek tartománya
A Ct értékek 15-35 között mozognak.Ha a Ct érték kisebb, mint 15, akkor úgy tekintjük, hogy az amplifikáció az alapperiódus tartományán belül van, és a fluoreszcencia küszöbértéket nem érte el.Ideális esetben lineáris kapcsolat van a Ct érték és a sablon kezdeti példányszámának logaritmusa, vagyis a standard görbe között.A standard görbén keresztül, amikor az amplifikációs hatékonyság 100%, a gén egymásolatszámának számszerűsítéséhez számított Ct érték 35 körül van. Ha nagyobb, mint 35, akkor a templát kezdeti kópiaszáma elméletileg kisebb, mint 1, ami értelmetlennek tekinthető.
Különböző gén Ct tartományok esetén a génkópiaszám és az amplifikációs hatékonyság különbsége miatt a kezdeti templát mennyiségben szükséges a gén standard görbéjének elkészítése és a gén lineáris kimutatási tartományának kiszámítása.
3. A Ct érték befolyásoló tényezői
Az amplifikációs ciklusok száma és a termék mennyisége közötti összefüggésből: az amplifikált termék mennyisége = a kezdeti templát mennyisége × (1+En) ciklusszám, látható, hogy ideális körülmények között a kezdeti templát és az En mennyisége negatív hatással lesz a Ct értékre.A sablon minősége vagy az erősítési hatékonyság különbsége miatt a Ct érték túl nagy vagy túl kicsi lesz.
4. A Ct érték túl nagy vagy túl kicsi
Feladás időpontja: 2023.02.22
