A Real Time PCR, más néven kvantitatív PCR vagy qPCR, a PCR amplifikációs termékek valós idejű monitorozására és elemzésére szolgáló módszer.
Mivel a kvantitatív PCR előnye az egyszerű működés, a gyors és kényelmes, a nagy érzékenység, a jó ismételhetőség és az alacsony szennyeződési arány, széles körben használják az orvosi vizsgálatokban, a gyógyszerhatékonyság értékelésében, a génexpressziós kutatásban, a transzgenikus kutatásban, a géndetektálásban, a kórokozók kimutatásában, az állatok és növények kimutatásában., élelmiszer-vizsgálati és egyéb területeken.
Ezért akár élettudományi alapkutatással foglalkozik, akár gyógyszeripari cégek, állattenyésztő cégek, élelmiszeripari cégek alkalmazottai, vagy akár belépési-kilépési ellenőrző és karanténirodák, környezetfelügyeleti osztályok, kórházak és egyéb egységek alkalmazottai, többé-kevésbé ki lesz téve a kvantitatív PCR elsajátításának ismereteinek.

A valós idejű PCR elve

A Real Time PCR egy olyan módszer, amelyben fluoreszcens anyagokat adnak a PCR reakciórendszerhez, és a PCR reakció folyamatában a fluoreszcens jel intenzitását kvantitatív PCR műszerrel valós időben követik nyomon, végül a kísérleti adatokat elemzik és feldolgozzák.

【Erősítési görbe】a PCR dinamikus folyamatát leíró görbe.A PCR amplifikációs görbéje valójában nem egy standard exponenciális görbe, hanem egy szigmoid görbe.

[Az erősítési görbe platformfázisa]A PCR-ciklusok számának növekedésével, a DNS-polimeráz inaktiválásával, a dNTP-k és primerek kimerülésével, a szintézis reakciójának a reakció mellékterméke pirofoszfáttal stb. történő gátlásával a PCR nem mindig bővül exponenciálisan., és végül egy fennsíkra lép.

[Az amplifikációs görbe exponenciális növekedési régiója]Bár a platófázis nagyon változó, az amplifikációs görbe exponenciális növekedési tartományának egy bizonyos tartományában az ismételhetőség nagyon jó, ami nagyon fontos a PCR kvantitatív elemzéséhez.

[Küszöbérték és Ct-érték]A fluoreszcencia detektálás határértékét az amplifikációs görbe exponenciális növekedési területének megfelelő pozíciójában állítottuk be, nevezetesen a küszöbértéket (Threshold).A küszöbérték és az erősítési görbe metszéspontja a Ct érték, vagyis a Ct érték a küszöbérték elérésekor a ciklusok számát (Threshold Cycle) jelenti.

Az alábbi grafikonon jól látható a küszöbvonal és az amplifikációs görbe, a küszöb és a Ct érték közötti kapcsolat.

【Hogyan kell számszerűsíteni?】

A matematikai elmélet bebizonyította, hogy a Ct érték fordított lineáris kapcsolatban áll a kezdeti sablonok számának logaritmusával.A Real Time PCR valós időben figyeli a PCR amplifikációs termékeket, és számszerűsíti azokat az exponenciális amplifikációs fázis során.

A PCR minden egyes ciklusában a DNS exponenciálisan kétszeresére nőtt, és hamarosan elérte a platót.

Feltéve, hogy a kiindulási DNS mennyisége A₀ n ciklus után a DNS-termék elméleti mennyisége a következőképpen fejezhető ki:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Ekkor minél nagyobb a DNS kezdeti A 0 mennyisége, annál hamarabb éri el az amplifikált termék mennyisége az An detektálási értéket, és az An elérésekor a ciklusok száma a Ct érték.Azaz minél nagyobb az A 0 kezdeti DNS-mennyiség, annál korábban éri el az amplifikációs görbe csúcsát, és ennek megfelelően annál kisebb a szükséges n ciklusszám.

Elvégezzük az ismert koncentrációjú standard gradiens hígítását, és templátként használjuk a valós idejű PCR-hez, és egyenlő időközönként amplifikációs görbék sorozatát kapjuk a DNS-mennyiség kiindulási sorrendjében többről kevesebbre.A Ct érték és a kezdősablonok számának logaritmusa közötti lineáris kapcsolat szerint a[standard görbe] létrehozható.

Az ismeretlen koncentrációjú minta Ct értékét a standard görbére behelyettesítve megkaphatjuk az ismeretlen koncentrációjú minta kezdeti templát mennyiségét, ami a Real Time PCR kvantitatív elve.

Valós idejű PCR kimutatási módszere

A valós idejű PCR a reakciórendszerben a fluoreszcencia intenzitásának detektálásával érzékeli a PCR amplifikációs termékeket.

A fluoreszcens festék beágyazási módszerének elve】

Fluoreszcens festékek, mint például a TB Green®, nem specifikusan kötődhet a kettős szálú DNS-hez PCR-rendszerekben, és kötődéskor fluoreszkál.

A reakciórendszerben a fluoreszcencia intenzitása exponenciálisan nőtt a PCR ciklusok növekedésével.A fluoreszcencia intenzitás kimutatásával valós időben nyomon követhető a reakciórendszerben a DNS-amplifikáció mértéke, majd fordítottan megbecsülhető a mintában lévő kiindulási templát mennyisége.

【A fluoreszcens szonda módszer elve】

fluoreszcens szondaegy nukleinsavszekvencia, amelynek 5'-végén egy fluoreszcens csoport, a 3'-végen pedig egy kioltócsoport található, amely specifikusan kötődni tud a templáthoz.Ha a próba sértetlen, a fluorofor által kibocsátott fluoreszcenciát a kioltó csoport kioltja, és nem tud fluoreszkálni.Amikor a szonda lebomlik, a fluoreszcens anyag disszociál és fluoreszcenciát bocsát ki.

Fluoreszcens próbát adunk a PCR reakcióoldathoz.A lágyítási folyamat során a fluoreszcens szonda a templát adott helyzetéhez kötődik.Az extenziós folyamat során a PCR enzim 5′→3′ exonukleáz aktivitása lebonthatja a templáttal hibridizált fluoreszcens próbát, és a fluoreszcens anyag disszociálva fluoreszcenciát bocsát ki.A reakciórendszerben a próba fluoreszcencia intenzitásának detektálásával elérhető a PCR termék amplifikációs mennyiségének monitorozása.

【A fluoreszcencia kimutatási módszer kiválasztása】

Ha nagy homológiájú szekvenciák megkülönböztetésére és multiplex PCR-detektálásra, például SNP tipizálási analízisre használják, a fluoreszcens próbamódszer pótolhatatlan.
Más valós idejű PCR-kísérletekhez egyszerű, könnyű és olcsó fluoreszcens kiméra módszer használható.

próbákErős specificitású, képes multiplex PCR-re

Hiányosság

Magas specifitási követelmények az erősítéshez;

multiplex PCR nem hajtható végre Specifikus szondák tervezése szükséges, magas költség;

néha nehéz a szonda tervezése

Kapcsolódó termékek: