A PCR a legszélesebb körben alkalmazott nukleinsav-amplifikációs technológia, amelyet érzékenysége és specificitása miatt széles körben alkalmaznak.A PCR azonban ismételt termikus denaturációt igényel, és nem szabadulhat meg a műszerekre és berendezésekre támaszkodó korlátoktól, ami korlátozza alkalmazását a klinikai terepi tesztelésben.

Az 1990-es évek eleje óta számos laboratórium kezdett olyan állandó hőmérsékletű erősítési technológiát fejleszteni, amely nem igényel termikus denaturációt.Most kifejlesztették a hurok által közvetített izoterm amplifikációs technológiát, a szál helyettesítő izoterm amplifikációs technológiát, a gördülő kör izoterm amplifikációs technológiát és a nukleinsavszekvencia-függőséget.Izotermikus erősítési technológia és egyéb technológiák. 

Loop-közvetített izoterm erősítés

Az amplifikációs elv azon a tényen alapul, hogy a DNS körülbelül 65 °C-on dinamikus egyensúlyi állapotban van.Ha bármely primer bázispáros, és a kettős szálú DNS komplementer részéig terjed, a másik szál disszociál és egyszálúvá válik.

Ezen a hőmérsékleten a DNS 4 specifikus primert használ, hogy egy szálkiszorító DNS-polimerázra támaszkodjon, hogy a szálkiszorító DNS szintézisét folyamatosan önkeringővé tegye.

Először határozza meg a 6 specifikus F3, F2, F1, B1, B2, B3 régiót a célgénen, majd tervezzen 4 primert e 6 specifikus régió alapján (ahogy az alábbi ábrán látható):

Az előremenő belső primer (FIP) F1c-ből és F2-ből áll.

A hátsó belső primer (BIP) B1c-ből és B2-ből áll, és a TTTT-t távtartóként használják középen.

Az F3 és B3 külső primerek a célgén F3 és B3 régióiból állnak.

A LAMP reakciórendszerben a belső primer koncentrációja többszöröse a külső primer koncentrációjának.A belső primert először a templátszállal kombinálják, hogy egy komplementer szálat szintetizáljanak, és így kettős DNS-szál jöjjön létre.Ezt követően a külső láncindítót a templátszállal kombinálják, így kettős DNS-szálat hoznak létre.A BstDNS polimeráz hatására felszabadul a belső primer által szintetizált komplementer szál.Egy sor reakció után a komplementer szál végül egyetlen, súlyzószerkezetű DNS-szálat alkot.

Magát a súlyzószerkezetű DNS egyszálát templátként használják egy átmeneti szárhurok szerkezetű DNS folyamatos kialakításához, nyitott véggel.A belső és külső primerek irányítják az átmeneti szár-hurok szerkezetű DNS-t, hogy folyamatosan szálkiszorítási és kiterjesztési reakciókon menjen keresztül, és végül többféle, különböző hosszúságú szárhurok szerkezetet hozzon létre.DNS keverék.

A hurok által közvetített izoterm erősítés előnyei és hátrányai

A LAMP előnyei:

(1) Magas amplifikációs hatékonyság, amely képes hatékonyan amplifikálni a célgén 1-10 kópiáját 1 órán belül, és az amplifikációs hatékonyság 10-100-szorosa a közönséges PCR-nek.

(2) A reakcióidő rövid, a specifitás erős, és nincs szükség speciális felszerelésre.

A LAMP hiányosságai:

(1) Az alapozókra vonatkozó követelmények különösen magasak.

(2) Az amplifikált termék klónozásra és szekvenálásra nem használható, csak megítélésre használható.

(3) Erős érzékenysége miatt könnyen képez aeroszolokat, téves pozitív eredményeket okozva, és befolyásolja a vizsgálati eredményeket.

Strand elmozdulás erősítése

A száleltolódásos amplifikáció (SDA) egy enzimes reakción alapuló in vitro izoterm DNS-amplifikációs technika, amelyet először Walker amerikai tudós javasolt 1992-ben.

Az SDA alaprendszere magában foglal egy restrikciós endonukleázt, egy szálkiszorító aktivitású DNS-polimerázt, két pár primert, dNTP-ket, valamint kalcium- és magnéziumionokat és pufferrendszereket.

A szálkiszorításos amplifikáció elve a cél-DNS mindkét végén található kémiailag módosított restrikciós endonukleáz felismerési szekvencián alapul.Az endonukleáz megnyitja a rést a DNS-szálban a felismerési helyén, a DNS-polimeráz pedig kiterjeszti a rést a 3'-végre, és helyettesíti a következő DNS-szálat.

A helyettesített egyszálú DNS-láncokat primerekkel kombinálhatjuk, és DNS-polimeráz segítségével kettős szálakká kiterjeszthetjük.Ez a folyamat folyamatosan ismétlődik, így a célszekvencia hatékonyan erősíthető.

A szálelmozdulás-erősítő technológia előnyei és hátrányai

Az SDA előnyei:

Az amplifikációs hatékonyság magas, a reakcióidő rövid, a specificitás erős, és nincs szükség speciális felszerelésre.

Az SDA hiányosságai:

A termékek nem egységesek, és néhány egyszálú és kétszálú termék mindig az SDA-ciklusban keletkezik, és az elektroforézissel történő észleléskor elkerülhetetlenül előfordul a farokképződés.

Rolling kör erősítés

A gördülő kör amplifikációját (RCA) a patogén organizmusok DNS-ének rolling circle segítségével történő másolásának módszere alapján javasolják.Ez arra utal, hogy egyszálú körkörös DNS-t használnak templátként állandó hőmérsékleten, és egy speciális DNS-polimerázt (például Phi29) ) A gördülő kör DNS-szintézisének hatására a célgén amplifikációja érhető el.

Az RCA lineáris erősítésre és exponenciális erősítésre osztható.A lineáris RCA hatékonysága elérheti a 10-et⁵alkalommal, és az exponenciális RCA hatékonysága elérheti a 10-et⁹alkalommal.

Egyszerű megkülönböztetés, amint az az alábbi ábrán látható, az a lineáris amplifikáció csak 1 primert használ, a b exponenciális amplifikáció 2 primert.

A lineáris RCA-t single primer RCA-nak is nevezik.A primer cirkuláris DNS-hez kötődik, és a DNS polimeráz hatására meghosszabbodik.A termék egy lineáris egyszálú, nagyszámú ismétlődő szekvenciával, amelyek több ezerszerese egyetlen hurok hosszának.

Mivel a lineáris RCA szorzata mindig az indítóprimerhez van kötve, a jel könnyű rögzítése nagy előnyt jelent.

Exponenciális RCA, más néven Hyper elágazó amplifikációs HRCA (Hyper branched RCA), az exponenciális RCA-ban az egyik primer amplifikálja az RCA terméket, a második primer hibridizál az RCA termékkel és meghosszabbodik, és a helyettesítés már az RCA termékhez kötődik.

A gördülő kör nukleinsav-amplifikáció előnyei és hátrányai

Az RCA előnyei:

Nagy érzékenység, jó specifitás és könnyű kezelhetőség.

Az RCA hiányosságai:

Háttérproblémák a jelfelismerés során.Az RCA-reakció során a nem keringtetett lakatpróba és a nem kötött próba templát DNS-e vagy RNS-e háttérjeleket generálhat. 

Nucleicsav szekvencia alapú amplifikáció

A nukleinsavszekvencia alapú amplifikáció (NASBA) egy új technológia, amelyet PCR alapján fejlesztettek ki.Ez egy folyamatos és izoterm nukleinsavamplifikáció, amelyet egy T7 promoterszekvenciával rendelkező primerpár irányít.A technológia körülbelül 109-szeresre képes amplifikálni a templát RNS-t körülbelül 2 óra alatt, ami 1000-szerese a hagyományos PCR-módszernek, és nem igényel speciális felszerelést.

Ezt a technológiát a betegségek gyors diagnosztizálására használták, amint megjelent, és jelenleg sok vállalat használja ezt a módszert RNS-detektáló készletekben.

Bár az RNS-amplifikáció reverz transzkripciós PCR technológiát is alkalmazhat, a NASBA-nak megvannak a maga előnyei: viszonylag állandó hőmérsékleti körülmények között is végrehajtható, stabilabb és pontosabb, mint a hagyományos PCR technológia.

A reakció 41 Celsius fokos, és AMV (madár myeloblastosis vírus) reverz transzkriptáz, RNáz H, T7 RNS polimeráz és egy pár primer szükséges a befejezéshez.

A folyamat elsősorban a következőket tartalmazza:

A forward primer tartalmazza a T7 promoter komplementer szekvenciáját.A reakció során a forward primer az RNS-szálhoz kötődik, és az AMV enzim katalizálja, így DNS-RNS kettős szál jön létre.

Az RNáz H megemészti a hibrid kettős szálú RNS-t, és megtartja az egyszálú DNS-t.

A fordított primer és az AMV enzim hatására a T7 promoter szekvenciát tartalmazó DNS kettős szál képződik.

A T7 RNS polimeráz hatására a transzkripciós folyamat befejeződik, és nagy mennyiségű cél RNS termelődik.

A NASBA előnyei:

(1) Primerje T7 promoter szekvenciával rendelkezik, de az idegen kettős szálú DNS-nek nincs T7 promoter szekvenciája és nem amplifikálható, így ez a technológia nagy specificitással és érzékenységgel rendelkezik.

(2) A NASBA közvetlenül beépíti a reverz transzkripciós folyamatot az amplifikációs reakcióba, lerövidítve a reakcióidőt.

A NASBA hátrányai:

(1) A reakciókomponensek bonyolultabbak.

(2) Háromféle enzim szükséges a reakció költségének növeléséhez.