Az RT-qPCR a molekuláris biológia alapkísérlete, és mindenkinek ismernie kell.Főleg három lépésből áll: RNS extrakció, reverz transzkripció cDNS-vé és valós idejű fluoreszcens kvantitatív PCR.Nem segít, mi történik?Valószínű, hogy probléma vana fordított transzkripciós kísérlet!Bár úgy tűnik, hogy a reverz transzkripciós kísérlethez csak RNS-t, dNTP-t, primereket ésreverz transzkriptáza centrifugacsőbe és jól keverjük össze, de a tényleges működési folyamatban még mindig sok részletre kell figyelni.Tanuljunk róla!

Hogyan ítéljük meg az RNS minőségét?
A cDNS kinyeréséhez az RNS minősége kritikus!Az RNS minőségét főként két szempontból lehet kimutatni:
(1) RNS integritás:Az RNS integritása agaróz gélelektroforézissel igazolható. Az eukarióták példájaként a teljes teljes RNS-nek három tiszta sávja van, a molekulatömeg a nagytól a kicsiig 28S, 18S és 5S, a 28S pedig kétszer olyan fényes, mint a 18S;ha három sáv látható, de a sáv típusa elmosódott vagy a diffúzió azt jelenti, hogy az RNS részlegesen lebomlott.Most azonnal hajtsa végre a fordított transzkripciós reakciót, és növelje megfelelően a sablonbevitelt;ha csak egy kis molekulatömegű sáv vagy nem látható sáv, az RNS teljesen lebomlott, és újra ki kell extrahálni.Az Agilent 2100 jelzi az RNS integritását csúcsdiagrammal és RIN értékkel.Ha a nukleinsav sértetlen, az elektroferogram alapvonala lapos;ha a nukleinsav erősen lebomlik, az alapvonal egyenetlen, és több degradációs csúcs jelenik meg;a RIN értéke az RNS integritását tükrözi, 0-10 tartományban, minél nagyobb az érték, annál jobb az RNS minősége.Nos, minél magasabb a teljesség foka.
(2) Az RNS tisztasága:Az OD260/280 arány UV spektrofotometriával detektálható.Ha az OD260/280 arány 1,9 és 2,1 között van, a tisztaság nagyon jó.
A maradék genomiális DNS pontatlan mennyiségi eredményekhez vezethet
Amikor az RNS-t kivonják, a kapott RNS összekeveredhet olyan genomiális DNS-sel (gDNS), amelyet nem tisztítottak meg.Ezért a reverz transzkripció után a cDNS is keveredikgDNS.Az alsó folyás soránqPCRreakció,cDNSés a gDNS egyidejűleg amplifikálódhat, ami viszonylag kis CT-értéket eredményez, így az eredmények torzak lehetnek.
Tehát mit tegyünk ebben a helyzetben?Foregenejavasolja:
(1) Végezzen genomtisztítást a fordított RNS-en, amely az RNS extrakció során oszlopextrakcióval eltávolítható;
(2) Kezelje az extrahált RNS-t DNázzalI , de fejezze be az EDTA-val;
reverz transzkripciós reagensekgenomtisztító modulokkal;

Hogyan válasszunk primereket a fordított transzkripcióhoz?
A reverz transzkripciós primerek szintén befolyásolják a reverz transzkripciós reakció kimenetelét.A reverz transzkripcióhoz véletlenszerű primereket, Oligo dT-t vagy génspecifikus primereket választhat a kísérlet konkrét körülményeinek megfelelően:
(1) Konkrét átiratok: génspecifikus primerek ajánlottak;
(2) Hosszú fragmentumátiratok: Oligo dT/gén-specifikus primerek ajánlottak;
(3) Hosszú szegmensű átiratok belső töredékei: génspecifikus primerek/ random primerek /random primerek + Oligo dT.Ha a következő qPCR-kísérletet végrehajtják, az Oligo dT önmagában nem használható, mivel az Oligo dT önmagában történő használata 3'-végi torzítást okozhat, ami pontatlan qPCR-kísérleteredményekhez vezethet;
(4) miRNS: szárhurkos alapozó vagy farokalapozó használható.

Hányszor kell hígítani a reverz transzkripciós termék cDNS-ét mennyiségi meghatározásához?
A reverz transzkripciós termék cDNS-ének megszerzése után nagyon fontos, hogy a cDNS-t hányszor kell hígítani a qPCR kísérletekhez.Ha a cDNS koncentrációja túl magas vagy túl alacsony, az befolyásolhatja az amplifikációs hatékonyságot.Mérhető-e a cDNS koncentrációja, és hogyan kell ezt megtenni?
(1) A reverz transzkripciós termék cDNS-koncentrációja nem mérhető, mert a reverz transzkripciós termék a cDNS-terméken kívül reverz transzkripciós maradék puffert, reverz transzkriptázt, primereket, stb. is tartalmaz, amelyek zavarják a koncentráció mérési eredményeket és az OD260/280 hozamot okozzák, ezért az OD260/23 arány nem abnormális.Ilyenkor néhány barát azt mondja, majd megmérem a koncentrációt tisztítás után;Itt a Foregene arra szeretne emlékeztetni, hogy a cDNS tisztítása nem javasolt, mert a visszafordítással kapott cDNS hossza eltérő, és a rövid cDNS elvész a tisztítás során.
(2) Szóval mit kell tenni?A qPCR kísérlet előtt a cDNS hígítási gradiense az előkísérleten keresztül meghatározható.Például: használjon cDNS törzsoldatot, 10-szeres hígítást és 100-szoros hígítást sablonként a qPCR-kísérletekhez, és válassza ki a hígítási tényezőt 18-28 CT-értékkel.

Hogyan kell a miRNS-eket reverz átírni?
A miRNS egyszálú kis molekulájú RNS, amelynek mérete körülbelül 22 nt, és nem kódol fehérjét.Rövid hossza miatt a hagyományos qPCR módszerrel nehéz közvetlenül számszerűsíteni, ezért gyakran szükséges a miRNS kiterjesztése;a miRNS általánosan használt reverz transzkripciós módszerei közé tartozik a szárhurok módszer és a farokmódszer.
A szárhurok módszer a miRNS kiterjesztése szárhurok primerek hozzáadásával.Ennek a kimutatási módszernek nagyobb az érzékenysége és specifitása, de az észlelési teljesítmény alacsony.Egy reverz transzkripció csak egy miRNS-t és egy belső referenciát képes kimutatni;a tail-addating módszer két részből áll. Két enzim együttes hatása teszi teljessé, ezek a PolyA polimeráz és a reverz transzkriptáz.A PolyA polimeráz felelős azért, hogy PolyA-farkat adjon a miRNS-hez annak hosszának növelése érdekében, a reverz transzkriptáz pedig reverz transzkripciós reakciót hajt végre.Ez a módszer nagy detektálási áteresztőképességgel rendelkezik, és több miRNS-t és belső referenciát is képes kimutatni egy reverz transzkripcióban, de az érzékenység és a specificitás alacsony a szárhurok módszerben.