PCR, többszörös PCR, In situ PCR, Fordított PCR, RT-PCR, qPCR (1)–PCR

Megvizsgáljuk a különféle PCR fogalmait, lépéseit és részleteit

Ⅰ. PCR

A polimeráz láncreakció, más néven PCR, egy molekuláris biológiai technológia, amelyet specifikus DNS-fragmensek megnagyobbítására használnak.Speciális DNS-replikációnak tekinthető in vitro.A DNS polimerázt (DNS Polymerase I) már 1955-ben, a kísérleti értékű és gyakorlatiasságú Klenow E. Coli-töredéket pedig Dr. H. Klenow fedezte fel az 1970-es évek elején, de mivel ez az enzim nem tolerálja a hőmérsékletet, a magas hőmérséklet degenerálhatja, így nem felel meg a magas hőmérsékletű polimeráz degenerációs láncreakciónak.A ma használatos enzimeket (úgynevezett Taq polimerázt) a Thermus aquaticusból, egy meleg forrásbaktériumból izolálták 1976-ban. Jellemzője, hogy ellenáll a magas hőmérsékletnek, ideális enzim, de az 1980-as évek után széles körben alkalmazzák.A PCR eredeti primitív prototípusának eredeti koncepciója hasonló a génjavításhoz és másoláshoz, amelyet Dr. KJell Kleppe javasolt 1971-ben. Ő publikálta az első egyszerű és rövid távú génmásolatot (hasonlóan a PCR első két ciklusreakciójához).A ma kifejlesztett PCR-t Dr. Kary B. Mullis fejlesztette ki 1983-ban. Dr. Mullis abban az évben PE-cégeket szolgált ki, így a PE különleges státusszal rendelkezik a PCR-iparban.Dr. Mullis 1985-ben jelentette meg hivatalosan az első kapcsolódó tanulmányt Saikivel és másokkal. Azóta a PCR használata több ezer mérföldet tesz ki naponta, és a kapcsolódó közlemények minősége elmondható, hogy sok más kutatási módszert kellemetlenné tesz.Ezt követően a PCR technológiát széles körben használják a biológiai tudományos kutatásokban és a klinikai alkalmazásokban, és a molekuláris biológiai kutatások legfontosabb technológiájává vált.Mullis 1993-ban elnyerte a kémiai Nobel-díjat is.

PCRElv

A PCR technológia alapelve hasonló a DNS természetes replikációs folyamatához, és specifitása a célszekvencia mindkét végével komplementer oligonukleotid primertől függ.A PCR három alapvető reakciólépésből áll: ①A templát DNS degenerációja: Miután a templát DNS-t egy bizonyos ideig kb. 93°C-ra melegítettük, a templát DNS elhagyásának PCR amplifikációjával létrejött kettős DNS-oldat egyláncúvá alakítja a következő kör primer reakcióját.②A templát DNS és a primer összekapcsolása (vegyülete): Miután a templát DNS-t felmelegítették és egyetlen láncra degenerálták, a hőmérséklet körülbelül 55 °C-ra csökken.A primer és a templát DNS komplementer szekvenciája egyláncú.③A primer kiterjesztése: DNS templát – a primer kötődése a TaqDNS polimeráz működésén alapul, a reakció alapanyaga a dNTP.Tartsa be a replikáció elvét, szintetizáljon egy új, félig fenntartott másolási láncot, amely kiegészíti a templát DNS-láncot, és ismételje meg a ciklus degeneráció-annealing-hosszabbítását, három folyamatban több „félig fenntartott másolási lánc” érhető el, és ez az új lánc újra elérhető. Legyen sablon a következő ciklushoz.A hurok befejezése 2-4 percet vesz igénybe, a célgén 2-3 óra alatt több milliószor amplifikálható.

AlapértelmezettPCRReakciórendszer

A PCR reakció öt eleme

Főleg ötféle anyag vesz részt a PCR reakcióban, nevezetesen primer, enzim, dNTP, templát és puffer (Mg2+ szükséges).[PCR eljárás]

A standard PCR folyamat három lépésből áll

1. DNS-degeneráció (90°C-96°C): Kétláncú DNS-templátok termikus hatás hatására, a hidrogénkötések megszakadnak, egyláncú DNS-t képezve.

2. Lágyítás (25 ℃ -65 ℃): A rendszer hőmérsékletét csökkentjük, a primert a DNS-templáttal kombináljuk, hogy helyi kettős láncot hozzunk létre.

3. Extension (70℃ -75℃): A Taq enzim hatására (kb. 72°C, a legjobb aktivitás) dNTP-t használnak nyersanyagként, a primer 5′-es végétől → 3′-végig terjed, a szintézis és a templát kiegészítik egymást DNS-láncok.

Minden ciklust denaturálnak, lágyítják és meghosszabbítják, megkétszerezve a DNS-tartalmat.Jelenleg a rövid amplifikációs terület miatt néhány PCR nagyon rövid idő alatt replikálható még akkor is, ha a Taq enzimaktivitás nem optimális, így két lépésre változtatható, vagyis az annealing és extenzió 60°C-65°C-on egyszerre is elvégezhető.Az emelés és hűtés folyamatának csökkentése és a válaszsebesség javítása érdekében.

A PCR reakció jellemzői

● Nagy specifitás

A PCR válasz specifikus döntő tényezői: ①A primer és a templát DNS specifikus kombinációja.②Az alappárosítás elve.③A TaqDNA polimeráz szintézis reakciójának hűsége.④A célgén specificitása és konzervatívsága.

Az alapozók és a sablonok megfelelő kombinációja a kulcs.A primer és a templát kötése, valamint a primer lánc meghosszabbítása a lúgos bázisillesztés elvén alapul.A polimeráz szintézis reakcióinak hűsége és a Taq DNS polimeráz magas hőmérsékleti ellenállása a templát és a primer kötődésének (vegyületének) létrehozásához a reakcióban magasabb hőmérsékleten is végrehajtható.A kombináció specifikussága jelentősen megnő.A klip nagyfokú korrektséget tud fenntartani.Magas konzervatív és nagy konzervatív genetikai célrégió kiválasztásával magasabb a specificitása.

● Nagy érzékenység

A PCR termékek gyártási volumenét index növeli, ami a Picker start template-jét (PG=10-12) bővítheti, így a mikrokontroller szintjét mikrogramm szintre (μg= -6) emelheti.Egy célsejt 1 millió sejtből mutatható ki;vírusok kimutatásában a PCR érzékenysége elérheti a 3 RFU-t (üres foltok alkotják egységeket);a bakteriális tudományban a minimális kimutatási arány 3 baktérium.

● Egyszerű és gyors

A PCR reflexió egy magas hőmérsékletű Taq DNS polimerázt használ, amely egyszerre adja hozzá a reakcióoldatot, azaz egy degenerációs-anneal-extension reakciót a DNS-amplifikációs oldaton és a vízfürdős edényen.Általában az amplifikációs reakció 2-4 óra alatt befejeződik.A kibővített termékeket általában elektromos karddal elemzik, és nem kell izotópokat használniuk, nincs radioaktív szennyezés, és egyszerű promóció.

● A minta tisztasága alacsony

Nincs szükség a vírusok vagy baktériumok szétválasztására és a sejtek tenyésztésére.A nyers DNS-termékek és az RNS erősítőkként használhatók.A DNS-amplifikáció kimutatása közvetlenül használható klinikai minták, például vér, testfolyadék, köhögés elleni mosófolyadék, haj, sejtek és élő szövetek felhasználásával.

PCRgyakori problémák

● Hamis negatív, nincs erősített sáv

A PCR reakció kulcsfontosságú szakaszai a következők: ① templát nukleinsavak előállítása, ② primerek minősége és specificitása, ③ enzimek minősége ④ PCR ciklus körülményei.Az ok megtalálását a fenti hivatkozások esetében is elemezni és tanulmányozni kell.

Templatek: ① A templát különféle fehérjét tartalmaz, ② A templát Taq enzim inhibitort tartalmaz, ③ A templátban lévő fehérje nem eliminálódik, különösen a kromoszómában lévő csoportfehérje.⑤ Deminer nukleinsav degeneráció nem alapos.Ha az enzimek és a primerek jó minőségűek, akkor nincs amplifikációs sáv, ami nagy valószínűséggel a minták emésztési kezelése.Valami nincs rendben a templát nukleinsav extrakciós eljárással, ezért a hatékony és stabil emésztési oldat elkészítéséhez rögzíteni kell az eljárást, és nem szabad önkényesen megváltoztatni.

Enzim-inaktiválás: új enzimet vagy régi és új enzimeket együtt kell használni annak elemzésére, hogy az enzimaktivitás elveszett-e vagy elégtelen-e, ami hamis negatív eredményhez vezet.Meg kell jegyezni, hogy a Taq enzimet vagy az etidium-bromidot néha elfelejtik.

Primer: a primer minősége, a primer koncentrációja, és hogy a két primer koncentrációja szimmetrikus-e.Ez gyakori oka a PCR sikertelenségének, vagy a növekvő sáv nem ideális és hajlamos a diffúzra.Problémák vannak egyes tételszámok alapozóinak minőségével.A két primernek magas és alacsony koncentrációja van, ami alacsony hatásfokú aszimmetrikus amplifikációt okoz.Az ellenintézkedések a következők: ① Válasszon egy jó primert az egységek szintetizálásához.② A primer koncentrációja nem csak az OD értéktől függ, hanem a primer eredeti folyadékára is figyel az agar cukorgél elektroforézishez.Kell lennie egy alapozócsík zónának, és a két alapozó fényerejének általában egyenletesnek kell lennie.Az öv, a PCR jelenleg meghiúsulhat, és ezt a primer szintézis egységgel kell feloldani.Ha egy alapozó magas, akkor a fényessége alacsony, és koncentrációjának kiegyensúlyozottnak kell lennie hígításkor.③ Az alapozót magas koncentrációban kell kifizetni és tárolni, hogy elkerüljük a hűtőszekrény többszöri lefagyását vagy hosszú távú hűtését, ami az alapozó tönkremeneteléhez és lebomlásához vezet.④ A primer kialakítása ésszerűtlen, például a primer hossza nem elegendő, és a primerek között diklaszter képződik.

Mg2+koncentráció: A Mg2+ion koncentráció nagy hatással van a PCR amplifikáció hatékonyságára.A túlzott koncentráció csökkentheti a PCR amplifikáció ellenkező nemét.Ha a koncentráció túl alacsony, a PCR amplifikációs kimenet még a PCR amplifikációt is meghiúsítja az expanziós sáv nélkül.

A reakciótérfogat változása: A PCR-amplifikációban használt térfogat 20ul, 30ul és 50ul vagy 100ul, a PCR-amplifikáció nagy mennyisége a tudományos kutatás és a klinikai tesztelés különböző céljainak megfelelően van beállítva.Kis mennyiségek (pl. 20 ul) készítése után a méret elkészítésekor zsinórfeltételt kell készíteni, különben meghibásodik.

Fizikai okok: A transzformáció nagyon fontos a PCR-amplifikáció szempontjából.Ha a degenerációs hőmérséklet alacsony, a degenerációs idő rövid, valószínűleg álnegatív esetén fordul elő;a túl alacsony hőkezelési hőmérséklet nem specifikus erősítést okozhat, és csökkenti a fajlagos erősítés hatékonyságát.Erősen befolyásolja a primerek és templátok kombinációját a PCR amplifikáció hatékonyságának csökkentése érdekében.Néha szabványos hőmérőket kell használni a hosszabbító vagy vízoldható tűzhely ingadozásának, hőkezelésének és meghosszabbított hőmérsékletének kimutatására, ami az egyik oka a PCR sikertelenségének.

Célszekvencia variánsok: Ha a célszekvencia bekövetkezik, mutáció vagy deléció, a prototípus és a templát kombinációja kombinálódik, vagy célszekvencia hiánya miatt a primer és a templát elveszti a komplementer szekvenciát, és annak PCR amplifikációja nem lesz sikeres.

● Hamis pozitív

A PCR amplifikációs sáv konzisztensnek tűnik a célszekvencia sávjával, és néha a sávja tisztább és magasabb.

A primer tervezése nem megfelelő: a kiválasztott amplifikációs szekvencia és a nem célzott amplifikációs szekvencia homológ, így PCR amplifikáció esetén az amplifikált PCR termékek nem célszerű szekvenciák.A célszekvencia túl rövid, vagy a primer túl rövid, és hajlamos téves pozitívra.Újra kell tervezni.

A célszekvencia vagy az amplifikációs termékek keresztszennyezése: Ennek a szennyezésnek két oka van: Először is, a teljes genom vagy nagy szegmensek keresztszennyezése, ami hamis pozitív eredményekhez vezet.Ez a fajta téves pozitív eredmény a következő módszerekkel oldható meg: Legyen óvatos és kíméletes működés közben, nehogy a célszekvencia belélegezzen a mintapisztolyba vagy kifröccsenjen a centrifugális csőből.Az enzimek és a magas hőmérsékletnek nem ellenálló anyagok kivételével minden reagenst vagy berendezést nagy nyomással fertőtleníteni kell.A centrifugálcsöveket és a mintákat egyszerre kell használni.Ha szükséges, a minták hozzáadása előtt a reakciócsövet és a reagenst ultraibolya sugárzásnak teszik ki, hogy elpusztítsák a meglévő nukleinsavat.Másodszor, kis töredékek a levegőszennyezésben.Ezek a kis fragmentumok rövidebbek, mint a célszekvencia, de bizonyos homológiát mutatnak.Egymással összeilleszthető.A primerek kiegészítése után a PCR termék kiterjeszthető, ami álpozitív termelést okoz.Használható a fészek PCR módszer csökkentésére vagy megszüntetésére.

● Nem specifikus erősítési sáv jelenik meg

A PCR amplifikáció után megjelenő sávok nem konzisztensek a várt mérettel, vagy nagyok vagy kicsik, vagy egyidejűleg, vagy egyidejűleg specifikus amplifikációs sávok és nem specifikus amplifikációs sávok.A nem specifikus sávok megjelenése a következő: Először is, a primerek nem komplementerek a célszekvenciával, vagy a primer polimerizációja diklasztert képez.A második az, hogy az MG2+ionok koncentrációja túl magas, a lágyítási hőmérséklet túl alacsony, és a PCR ciklusok száma összefügg.Másodszor, az enzimek minősége és mennyisége.Gyakran előfordul, hogy egyes forrásokból származó enzimek hajlamosak nem speciális sávokra, és a másik forrás enzimei nem fordulnak elő.Néha az enzimek nem specifikus amplifikációja is előfordul.Az ellenintézkedések a következők: szükség esetén újratervezzük a vonzerőt.Csökkentse az enzim mennyiségét, vagy cserélje ki más forrásból származó enzimet.Csökkentse az elsődleges mennyiséget, növelje megfelelően a sablonok számát, és csökkentse a ciklusok számát.Megfelelően növelje az izzítási hőmérsékletet, vagy használja a két hőmérsékletpontos módszert (93 °C-os degeneráció, lágyítás és nyújtás körülbelül 65 °C-on).

● Tegyen foltos kócot vagy kenőszalagot

Néha úgy tűnik, hogy PCR-amplifikációt alkalmaznak, héjas vagy szőnyegszerű övet.Emiatt a túlzott enzimmennyiség vagy az enzim rossz minősége miatt túl magas a dNTP koncentráció, túl magas a Mg2+ koncentráció, túl alacsony a lágyítási hőmérséklet és túl sok a ciklusszám.Az ellenintézkedések a következők: ①Csökkentse az enzimek mennyiségét, vagy cserélje ki más forrásból származó enzimet.②Csökkentse a dNTP koncentrációját ③Csökkentse megfelelően a Mg2+ koncentrációt.④Növelje a sablonok számát és csökkentse a ciklusok számát.

Kapcsolódó termékek

PCR Heroᵀᴹ (festékkel)

◮ Magasabb pontosság: hatszor nagyobb, mint a hagyományos Taq enzimnél;

◮ Gyorsabb erősítési sebesség

◮ Nagyobb alkalmazkodóképesség a sablonokhoz

◮ Magasabb erősítési hatásfok

◮ A környezeti tolerancia erősebb: egy hétig 37°C-on tartva, több mint 90%-os aktivitás fenntartása mellett;

◮ 5'→3' DNS polimeráz aktivitással és 5'→3' exonukleáz aktivitással rendelkezik, 3'→5' exonukleáz aktivitás nélkül.

PCR Easyᵀᴹ (festékkel)

Az egyedülálló reakciórendszer és a nagy hatékonyságú Taq DNS polimeráz a PCR-reakciót magasabb amplifikációs hatékonyságot, specificitást és érzékenységet eredményez.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-SYBR Green I

◮ Az egylépéses készlet a reverz transzkripciót és a qPCR-t két reakcióvá teszi ugyanabban a csőben, csak templát RNS-t, specifikus PCR primereket és RNáz-mentes ddH-t kell hozzáadni.₂O.

◮ A készlet gyorsan és hatékonyan képes kvantitatívan elemezni a vírus RNS-t vagy nyomon követni az RNS-t.

◮ A készlet egyedi Foregene reverz transzkripciós reagenst és Foregene HotStar Taq DNS polimerázt használ, egyedi reakciórendszerrel kombinálva, hogy hatékonyan javítsa az amplifikációs hatékonyságot és a reakció specifitását.

◮ Az optimalizált reakciórendszernek köszönhetően a reakció nagyobb érzékelési érzékenységgel, erősebb termikus stabilitással és jobb toleranciával rendelkezik.

◮ RT-qPCR Easy^TMAz (One Step)-SYBR Green I készlet ROX belső referenciafestéket tartalmaz, amely a jel hátterének és a kutak közötti jelhibák kiküszöbölésére használható, ami kényelmes az ügyfelek számára a kvantitatív PCR-műszerek különböző modelljeiben.

RT Easy^TMII (Master Premix for első szálú cDNS szintézis számáraValós idejű PCR)

- Hatékony gDNS eltávolítási képesség, amely 2 percen belül képes eltávolítani a gDNS-t a sablonból.

- Hatékony reverz transzkripciós rendszer, mindössze 15 percet vesz igénybe az első szál cDNS szintézise.

- Összetett sablonok: a magas GC tartalmú és összetett másodlagos szerkezetű sablonok is nagy hatékonysággal visszafordíthatók.

-Nagy érzékenységű reverz transzkripciós rendszer, pg-szintű templátok is kaphatnak kiváló minőségű cDNS-t.

-A reverz transzkripciós rendszer nagy termikus stabilitással rendelkezik, az optimális reakcióhőmérséklet 42 ℃, és még mindig jó a fordított transzkripciós teljesítménye 50 ℃-on.