A PCR (polimeráz láncreakció) az egyik in vitro DNS-amplifikációs technológia, több mint 30 éves múltra tekint vissza.

A PCR-technológia úttörője Kary Mullis, a Cetus (USA) volt 1983-ban. Mullis 1985-ben PCR-szabadalmat kért, és ugyanebben az évben publikálta az első PCR-tudományos tanulmányt.Mullis munkásságáért 1993-ban kémiai Nobel-díjat kapott.

A PCR alapelvei

A PCR több mint egymilliószorosára képes amplifikálni a cél DNS-fragmenseket.Az alapelv a DNS-polimeráz katalizálása alatt áll, templátként a szülőszálú DNS-t és a kiterjesztéshez specifikus primert használva.In vitro replikálódik olyan lépéseken keresztül, mint a denaturáció, a lágyítás és az extenzió.Az anyaszál templát DNS-sel komplementer leányszálú DNS folyamata.

A standard PCR folyamat három lépésből áll:

1. Denaturáció: Magas hőmérsékletet használjon a DNS kettős szálak elválasztására.A DNS kettős szálai közötti hidrogénkötés magas hőmérsékleten (93-98 ℃) megszakad.

2. A kétszálú DNS szétválasztása után csökkentse a hőmérsékletet, hogy a primer kötődhessen az egyszálú DNS-hez.

3. Extension: A DNS-polimeráz a hőmérséklet csökkentésével komplementer szálakat kezd szintetizálni a DNS-szálak mentén a megkötött primerekből.Amikor a kiterjesztés befejeződött, egy ciklus befejeződik, és a DNS-fragmensek száma megduplázódik

Ha ezt a három lépést 25-35-ször viszonozza, a DNS-fragmensek száma exponenciálisan megnő.

A PCR ötletessége, hogy különböző primerek tervezhetők különböző célgénekhez, így a célgén-fragmensek rövid időn belül amplifikálhatók.

A PCR eddig három kategóriába sorolható, nevezetesen a közönséges PCR-re, a fluoreszcens kvantitatív PCR-re és a digitális PCR-re.

A közönséges PCR első generációja

Használjon közönséges PCR amplifikációs műszert a célgén amplifikálásához, majd agaróz gélelektroforézist alkalmazzon a termék kimutatására, csak kvalitatív elemzés végezhető.

Az első generációs PCR fő hátrányai:

1. Hajlamos a nem specifikus amplifikációra és hamis pozitív eredményekre.

2.Az észlelés sokáig tart, és a művelet nehézkes.

3.Csak kvalitatív teszt végezhető

Második generációs valós idejű PCR

A valós idejű PCR, más néven qPCR, fluoreszcens szondákat használ, amelyek jelezhetik a reakciórendszer előrehaladását, és figyeli az amplifikált termékek felhalmozódását a fluoreszcens jelek felhalmozódásán keresztül, és az eredményeket a fluoreszcencia görbe alapján ítéli meg.Cq érték és standard görbe segítségével számszerűsíthető.

Mivel a qPCR technológia zárt rendszerben valósul meg, így a szennyeződés valószínűsége csökken, a fluoreszcencia jel kvantitatív kimutatás céljából követhető, így a klinikai gyakorlatban a legszélesebb körben alkalmazott és a PCR domináns technológiájává vált.

A valós idejű fluoreszcens kvantitatív PCR-ben használt fluoreszcens anyagok a következőkre oszthatók: TaqMan fluoreszcens szonda, molekuláris jelzőfények és fluoreszcens festék.

1) TaqMan fluoreszcens szonda:

A PCR-amplifikáció során egy specifikus fluoreszcens próbát adunk hozzá, miközben egy pár primert adunk hozzá.A próba egy oligonukleotid, és mindkét vége egy riporter fluoreszcens csoporttal és egy kioltó fluoreszcens csoporttal van megjelölve.

Amikor a próba sértetlen, a riportercsoport által kibocsátott fluoreszcens jelet a kioltó csoport elnyeli;A PCR amplifikáció során a Taq enzim 5'-3' exonukleáz aktivitása hasítja és lebontja a próbát, így a riporter fluoreszcens csoport és kioltó A fluoreszcens csoport szétválik, így a fluoreszcencia monitorozó rendszer képes fogadni a fluoreszcencia jelet, vagyis minden alkalommal, amikor egy DNS-szál fluoreszcens, a szál fluoreszcenciája és a szál fluoreszcenciája megtörténik. teljesen szinkronban van a PCR-termék képződésével.

2) SYBR fluoreszcens festék:

A PCR reakciórendszerben feleslegben SYBR fluoreszcens festéket adnak hozzá.Miután a SYBR fluoreszcens festék nem specifikusan beépült a DNS kettős szálba, fluoreszcens jelet bocsát ki.A láncba nem beépült SYBR festékmolekula nem bocsát ki fluoreszcens jelet, ezzel biztosítva a fluoreszcens jelet. A PCR termékek növekedése teljes mértékben szinkronban van a PCR termékek növekedésével.A SYBR csak kétszálú DNS-hez kötődik, így az olvadási görbe alapján megállapítható, hogy a PCR reakció specifikus-e.

3) Molekuláris jeladó:

Ez egy szárhurok kettős jelölésű oligonukleotid próba, amely körülbelül 8 bázisból álló hajtűszerkezetet alkot az 5. és 3. végén.A nukleinsavszekvenciák mindkét végén komplementeren párosulnak, ami a fluoreszcens csoportot és a kioltócsoportot szorossá teszi.Zárja be, nem képződik fluoreszcencia.

A PCR-termék előállítása után az annealing folyamat során a molekuláris beacon középső részét egy specifikus DNS-szekvenciával párosítják, és a fluoreszcens gént elválasztják a kioltó géntől, hogy fluoreszcenciát hozzon létre.

A második generációs PCR fő hátrányai:

Az érzékenység továbbra is hiányzik, és az alacsony példányszámú minták észlelése pontatlan.

A háttérérték befolyása van, és az eredmény érzékeny az interferenciára.

Ha a reakciórendszerben PCR-inhibitorok vannak, a detektálási eredmények érzékenyek az interferenciára.

Harmadik generációs digitális PCR

A digitális PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) a végpont-detektáláson keresztül kiszámítja a célszekvencia kópiaszámát, és pontos abszolút kvantitatív kimutatást tud végezni belső kontrollok és standard görbék használata nélkül.

A digitális PCR végpont-detektálást használ, és nem függ a Ct-értéktől (ciklusküszöb), így a digitális PCR reakciót kevésbé befolyásolja az amplifikációs hatékonyság, és javul a PCR reakciógátlókkal szembeni tolerancia, nagy pontossággal és reprodukálhatósággal.

A nagy érzékenység és a nagy pontosság miatt a PCR-reakciót gátló szerek nem zavarják könnyen, és standard termékek nélkül is valódi abszolút kvantifikációt tud elérni, amely kutatási és alkalmazási hotspottá vált.

A reakcióegység különböző formái szerint három fő típusra osztható: mikrofluidikus, chip- és csepprendszerekre.

1) Mikrofluidikus digitális PCR, mdPCR:

A mikrofluidikus technológia alapján a DNS-templát elválasztásra kerül.A mikrofluidikus technológia megvalósíthatja a minták nano-javítását vagy kisebb cseppek generálását, de a cseppek speciális adszorpciós módszert igényelnek, majd kombinálják a PCR reakciórendszerrel.Az mdPCR-t fokozatosan más módszerek váltják fel.

2) Csepp alapú digitális PCR, ddPCR:

Víz az olajban cseppgenerálási technológiával dolgozza fel a mintát cseppekké, és ossza fel a nukleinsavmolekulákat tartalmazó reakciórendszert több ezer nanoméretű cseppre, amelyek mindegyike nem tartalmazza a kimutatandó nukleinsav célmolekulát, vagy egy vagy több vizsgálandó nukleinsav célmolekulát tartalmaz.

3) Chip alapú digitális PCR, cdPCR:

Használja az integrált folyadékút-technológiát sok mikrocső és mikroüreg szilíciumlapokra vagy kvarcüvegre való gravírozására, és az oldat áramlásának szabályozására különböző szabályozószelepeken keresztül, és a mintafolyadékot azonos méretű nanométerekre osztja a reakcióüregekbe a digitális PCR-reakcióhoz az abszolút mennyiségi meghatározás elérése érdekében.

A harmadik generációs PCR fő hátrányai:

A berendezések és a reagensek drágák.

A sablon minőségi követelményei magasak.Ha a sablon mennyisége meghaladja a mikrorendszer mennyiségét, akkor nem lehet számszerűsíteni, ha pedig túl kicsi, akkor a kvantifikációs pontosság csökken.

Hamis pozitív eredmények is generálhatók, ha nem specifikus erősítés van.