A COVID-19 egy fertőző betegség, amelyet a 2-es típusú koronavírus súlyos akut légzőszervi szindróma okoz. Ha egy személy fertőzött, a leggyakoribb tünetek a láz, a köhögés és a légszomj.

A vizsgálathoz használt minták nasopharyngeális vagy oropharyngeális tamponnal gyűjthetők.

Mi az a PCR?

A koronavírus kimutatásának standard módszere a polimeráz láncreakció, a PCR.Ezt a módszert széles körben használják a molekuláris biológiában.Gyorsan képes másolni több milliótól milliárdig specifikus DNS-fragmentumot.

Az új koronavírus nagyon hosszú egyszálú RNS genomot tartalmaz.Ahhoz, hogy ezeket a vírusokat PCR-rel kimutathassuk, az RNS-molekulákat reverz transzkriptázzal komplementer DNS-szekvenciáikká kell alakítani, majd az újonnan szintetizált DNS-t standard PCR-eljárásokkal, közismertebb nevén RT-PCR-rel amplifikálni lehet.

RT-PCR folyamat

RNS extrakció

Ennek a módszernek a végrehajtásához a vírus RNS-t alapvetően ki kell vonni.Különféle RNS-tisztító készletek használhatók a kényelmes, gyors és hatékony elválasztáshoz.

A vírus RNS-nek egy kereskedelmi készlettel történő extrahálásához először adja a mintát egy mikrocentrifugacsőbe, majd keverje össze a lízispufferrel.Ez a puffer erősen denaturált, és általában fenolból és guanidin-izotiocianátból áll.Ezenkívül az RNáz inhibitorok általában jelen vannak a lízispufferben, hogy biztosítsák az intakt vírus RNS izolálását.

A lízispuffer hozzáadása után vortexelje a keverőcsövet impulzussal, és inkubálja szobahőmérsékleten.A vírust ezután a lízispuffer által biztosított erősen denaturáló körülmények között lizálják.

A minta lizálása után centrifugacsövet használunk a tisztítási eljáráshoz.A mintát a centrifugacsőbe töltjük, majd centrifugáljuk.

Ez az eljárás szilárd fázisú extrakciós eljárás, amelyben az állófázis szilikagél mátrixból áll.

Optimális só- és pH-körülmények között az RNS-molekulák a szilícium-dioxid membránhoz kötődnek.

Ezzel egyidejűleg eltávolítják a fehérjét és más szennyeződéseket.

Centrifugálás után helyezze a centrifugacsövet egy tiszta gyűjtőcsőbe, dobja ki a szűrletet, majd adjon hozzá mosópuffert.

Helyezze a csövet ismét a centrifugába, hogy a mosópuffert átnyomja a membránon.Ez eltávolítja az összes megmaradt szennyeződést a membránról, és csak az RNS marad a szilikagélhez kötve.

A minta megmosása után helyezze a csövet egy tiszta mikrocentrifugacsőbe, és adja hozzá az elúciós puffert.

Ezután centrifugálják, hogy az elúciós puffert átnyomják a membránon.Az elúciós puffer eltávolítja a virális RNS-t a spin oszlopról, és tisztított, fehérjéktől, inhibitoroktól és egyéb szennyeződésektől mentes RNS-t nyer.

2. LÉPÉS

Vegyes koncentrátum

A vírus RNS extrahálása után a következő lépés a reakcióelegy előkészítése a PCR-amplifikációhoz.Ebben a lépésben koncentrátumot használnak.Ez a koncentrált oldat egy előkevert koncentrált oldat, amely premixből, reverz transzkriptázból, nukleotidokból, forward primerből, reverz primerből, TaqMan próbából és DNS polimerázból áll.

Végül a reakcióelegy befejezéséhez hozzáadjuk az RNS-templátot.A csöveket impulzusos vortexeléssel összekeverjük, majd a reakcióelegyet a PCR lemezre töltjük.A PCR lemez általában 96 mérőhelyet tartalmaz, és egyszerre több mintát is képes elemezni.

3. LÉPÉS

PCR amplifikáció

Ezután helyezze a lemezt a PCR-gépbe, amely lényegében egy hőciklus.

A valós idejű RT-PCR-t a 2019-es új koronavírus kimutatására használják az RdrRP génben, az E génben és az N génben lévő célszekvencia amplifikálásával.A célgén kiválasztása a primertől és a próbaszekvenciától függ.

Az RT-PCR első lépése a reverz transzkripció.A komplementer DNS első szála szintetizálódik, amelyet a PCR reverz primer indít el, amely a vírus RNS genomjának komplementer részéhez kötődik.Ezután a reverz transzkriptáz DNS-nukleotidokat ad a primer 3'-végéhez, hogy szintetizálja a vírus RNS-sel komplementer DNS-t.Ennek a lépésnek a hőmérséklete és időtartama a használt primerektől, cél RNS-től és reverz transzkriptáztól függ.

Ezután egy kezdeti denaturációs lépést alkalmazunk, amely az RNS-DNS hibrid denaturálódását eredményezi.Ez a lépés szükséges a DNS-polimeráz aktiválásához.Ugyanakkor a reverz transzkriptáz inaktiválódik.

A PCR termikus ciklusok sorozatából áll.Minden ciklus denaturálási, lágyítási és kiterjesztési lépésekből áll.

A denaturálási lépésben a reakciókamrát 95 Celsius-fokra melegítjük, és a kétszálú DNS-templát denaturálására használjuk.

A következő lépésben a reakcióhőmérsékletet 58 Celsius-fokra csökkentjük, lehetővé téve, hogy az előremenő láncindító az egyszálú DNS-templát komplementer részéhez kapcsolódjon.A lágyítási hőmérséklet közvetlenül függ a primer hosszától és összetételétől.

Az extenziós lépésben a DNS-polimeráz egy új DNS-szálat szintetizál, amely komplementer a DNS-templát szálhoz.A templáttal komplementer szabad magok hozzáadásával a reakcióelegytől 5′-3′ irányban.Ennek a lépésnek a hőmérséklete az alkalmazott DNS-polimeráztól függ.

Az első ciklus után kettős szálú DNS-célpontot kapunk.

Ezután lépjen be a második ciklusba.A kétszálú DNS-t denaturálják, így két egyszálú DNS-molekula keletkezik.

A következő lépésben a reakcióhőmérsékletet csökkentjük, a primereket az egyes egyszálú DNS-templátokhoz illesztjük, és a Taq-man próbát a cél-DNS komplementer részéhez kapcsoljuk.

A TaqMan próba egy fluoroforból áll, amely kovalensen kapcsolódik az oligonukleotid próba 5′ végéhez.Amikor a cikluskapcsoló fényforrása gerjeszti, a fluorofor fluoreszcenciát bocsát ki.Ezenkívül a szonda egy kioltóból áll a 3′ végén.A riportergén közelsége a kioltóhoz megakadályozza a fluoreszcencia kimutatását.

A kiterjesztési lépésben a DNS-polimeráz új szálat szintetizál.Amikor a polimeráz eléri a TaqMan próbát, endogén 5′nukleáz aktivitása elhasítja a próbát, elválasztva a festéket a kioltótól.

A PCR minden egyes ciklusával több festékmolekula szabadul fel, ami a szintetizált amplikonok számával arányos fluoreszcencia intenzitásnövekedést eredményez.

Ez a módszer lehetővé teszi egy adott szekvencia számának becslését a mintában.A kétszálú DNS-fragmensek száma minden ciklusban megduplázódik.Ezért a PCR nagyon kis minták elemzésére használható.

Fluoreszkáló jel mérésére wolfram halogén lámpát, gerjesztő szűrőt, reflektort, lencsét, emissziós szűrőt és töltéscsatolt eszközt használjon CCD kamerát.

4. LÉPÉS Észlelés

Fluoreszkáló jel mérésére wolfram halogén lámpát, gerjesztő szűrőt, reflektort, lencsét, emissziós szűrőt és töltéscsatolt eszközt használjon CCD kamerát.

A lámpából kiszűrt fényt a reflektor visszaveri, áthalad a kondenzátorlencsén, és minden lyuk közepére fókuszál.Ezután a lyukból kibocsátott fluoreszcencia visszaverődik a tükörről, áthalad az emissziós szűrőn, és a CCD kamera érzékeli.Minden PCR ciklusban az öngerjesztett fluorofor fényt a CCD érzékeli.

A rögzített fényt digitális adatokká alakítja.Ezt a módszert valós idejű PCR-nek nevezik, és lehetővé teszi a PCR reakció előrehaladásának valós idejű nyomon követését.