Mindenki a qRT-PCR kísérlet elvét, primer tervezést, eredmény értelmezést stb. beszéli, de szerintem meg kell osztanom veletek a qRT-PCR kísérleti működését.Kicsi, de az eredményekről szól.
A qRT-PCR elvégzése előtt világosan meg kell értenünk saját RNS-ünket és működési módszereinket.Végül is erőfeszítéseink az eredmények elérésére irányulnak, nem pedig a gyakorlásra.Tehát a qRT-PCR elvégzése előtt meg kell határoznunk a következő problémákat (amelyek közül néhány csak a SYBR-re vonatkozik).
1 Biztos vagy benne, hogy nem bomlott le az RNS-e?
A NanoDrop 2000 csak az RNS koncentrációját és tisztaságát képes kimutatni, de az RNS integritását nem képes kimutatni.
Az RNS (RNS Intesity Number) értéke tükrözheti az RNS integritását, amelyet az Agilent 2100 Bioanalyzer rendszer észlel.
ábra RIN-értékek sematikus diagramja különböző RNS-mintákhoz (eukarióták)
A laboratóriumokban azonban általában nincs Agilent 2100 Bioanalyzer.Ebben az esetben formaldehid gélen keresztül tudjuk kimutatni, de az RNS összmennyiség igénye magas, ezért a leggyorsabb módszer a közönséges gélelektroforézis.Nukleázmentes környezetben kell lennie, ezért az elektroforézis tartályt, a szol palackot, a géltartót és a fésűt DEPC vízzel le kell öblíteni.Az agaróz szintén nukleázmentes (amíg frissen van felbontva), és a Loading Buffert lehetőleg frissen kell kinyitni, 1,2%-os géllel.
Vegye figyelembe, hogy a gélnek teljesen fel kell oldódnia, különben inhomogén sávokat okoz, amint az az ábra 9. mintájában látható.Ha a feszültség túl magas vagy túl sokáig működik, az hőt termel, és az RNS lebomlását okozza, ezért a feszültséget és az időt ésszerűen kell szabályozni.Ezen túlmenően a gél futtatása azt is meghatározhatja, hogy van-e DNS-maradvány a mintában, és megfigyelhető, hogy van-e nagy számú visszatartott sáv az adagolóüregben.
Ábra.RNS gélelektroforézis kimutatása
2 Biztos vagy a cDNS koncentrációjában?
A laboratóriumi nagytestvérek tapasztalata az, hogy az egyes inverziókkal kapott 20 ul-es rendszer cDNS-e közvetlenül 20-szoros, míg a posztdoktori nővérek 10-szeresére hígulnak.Általában a helyzettől függök.Mivel az egyes személyek által említett RNS minősége eltérő, a visszafordítás mértéke is eltérő, és előfordulhat, hogy a visszafordítási technológia sem stabil.
Tehát minden alkalommal, amikor megkapom a fordított cDNS-t, először körülbelül háromszorosára hígítom, majd a housekeeping gént használom az RT-PCR elvégzéséhez, a ciklusok száma általában 25 ciklus, hogy azonosítsam a konkrét koncentrációt, majd meghatározzam a végső hígítási tényezőt.
3 Biztos vagy benne, hogy az alapozókat könnyű használni?
Át tudja vinni a qRT-PCR olvadási görbéjét, de ez még mindig pénzbe kerül.A sok pénzzel nem rendelkező laboratóriumok, amikor sok primert kapnak, közönséges RT-PCR-rel ellenőrizhetik, hogy egyetlen sávról van-e szó, és azonosíthatják a primerek specifitását.Ha a laboratórium nem szűkölködik pénzben, az olvadási görbén keresztül az összes primer specifitása egyszer azonosítható.
4 Biztos benne, hogy a kísérleti körülményei megfelelőek?
A SYBR-t óvni kell az erős fénytől, ezért próbálja meg kikapcsolni a felső lámpát a SYBR reagens hozzáadásakor, és csak gyenge fényt kell használnia a befejezéshez.
A SYBR-t 4°C-on tárolja.Használat közben óvatosan fordítsa fel és le, hogy jól keverje össze a habképződés elkerülése érdekében, és ne keverje erősen.
Néhány fiatalabb nővér szeretne jeleket rajzolni a PCR-táblára, mert attól tart, hogy összekeverik a mintákat, ami helytelen.Mivel a markerei nagy valószínűséggel befolyásolják a fluoreszcens jelek gyűjtését, általában azt javaslom, hogy a fiatalok kísérleti jegyzetfüzeteket használjanak a memória segítésére, amint az alább látható.
Ábra.qRT-PCR mintabetöltési diagram
5 Biztos vagy benne, hogy jól csinálod?
Mindenképpen viseljen kesztyűt, viseljen kesztyűt, viseljen kesztyűt, és háromszor mondjon el fontos dolgokat.
A SYBR fénynek való kitettségének csökkentése érdekében személy szerint először egy sablont szeretnék hozzáadni, amint az az alábbi ábrán látható.A tapasztalatok szerint kis mennyiségű sablon hozzáadása valószínűleg mintavételi hibákat okoz.Ezért a kis mennyiségű sablon hozzáadása okozta hiba minimalizálása érdekében általában ismét megduplázom a mintát, a minta hozzáadásakor pedig a mennyiséget, hogy csökkentsem a hozzáadott H2O2 mennyiségét.
Ábra.A qRT-PCR terhelés sematikus diagramja
Ezután konfigurálja a qRT-PCR rendszert az alábbiak szerint.
Ábra.qRT-PCR rendszer előkészítési diagramja
MEGJEGYZÉS: A konfigurációs folyamatot jégen kell elvégezni.
A minta hozzáadása után ragassza be az átlátszó tömítőfóliát.Lehetőleg ne érintse meg kézzel az átlátszó tömítőfólia felületét, csak a fólia mindkét oldalán lévő helyről működjön.Mivel az ujjlenyomatok a fluoreszcens jelek gyűjtését is befolyásolhatják.Ezután egy centrifugával gyorsan centrifugáljon 10 másodpercig alacsony sebességgel, nehogy a minta a falon lógjon.
Kapcsolódó termékek:
Feladás időpontja: 2023.04.28
