一, Növelje a reakciórendszer érzékenységét:

1. Kiváló minőségű RNS izolálása:

A sikeres cDNS-szintézis kiváló minőségű RNS-ből származik.A jó minőségű RNS-nek legalább teljes hosszúságúnak kell lennie, és mentesnek kell lennie reverz transzkriptáz inhibitoroktól, például EDTA-tól vagy SDS-től.Az RNS minősége határozza meg a cDNS-be átírható szekvenciainformáció maximális mennyiségét.Az elterjedt RNS-tisztítási módszer egy egylépéses módszer, guanidin-izotiocianát/savas fenol alkalmazásával.Az RNáz nyomokban történő szennyeződésének megelőzése érdekében az RNázban gazdag mintákból (például a hasnyálmirigyből) izolált RNS-t formaldehidben kell tárolni a kiváló minőségű RNS megőrzése érdekében, különösen hosszú távú tárolás esetén.A patkánymájból kivont RNS alapvetően lebomlott egy hét vízben való tárolás után, míg a patkánylépből extrahált RNS 3 év vízben való tárolás után is stabil maradt.Ezenkívül a 4 kb-nál hosszabb transzkriptumok érzékenyebbek a nyomnyi RNázok általi lebontásra, mint a kis átiratok.A tárolt RNS-minták stabilitásának növelése érdekében az RNS ionmentesített formamidban oldható és -70°C-on tárolható.Az RNS megőrzésére használt formamidnak mentesnek kell lennie az RNS-t lebontó törmeléktől.A hasnyálmirigyből származó RNS formamidban legalább egy évig megőrzhető.Az RNS használatára való felkészülés során a következő módszert használhatja az RNS kicsapására: adjon hozzá NaCl-t 0,2 M és 4-szeres térfogatú etanolhoz, helyezze szobahőmérsékleten 3-5 percre, és centrifugálja 10 000 × g-vel 5 percig.

2. Használja az RNaseH-inaktív (RNaseH-) reverz transzkriptázt:

RNáz inhibitorokat gyakran adnak a reverz transzkripciós reakciókhoz, hogy növeljék a cDNS szintézis hosszát és hozamát.Az RNáz inhibitorokat az első szál szintézis reakciója során kell hozzáadni puffer és redukálószer (például DTT) jelenlétében, mert a cDNS szintézis előtti folyamat denaturálja az inhibitort, ezáltal felszabadul a kötött RNáz, amely képes lebontani az RNS-t.A fehérje RNáz inhibitorok csak az RNS A, B, C általi lebomlását akadályozzák meg, és nem akadályozzák meg az RNázt a bőrön, ezért ügyeljen arra, hogy ezen inhibitorok használata ellenére ne vigye be az RNázt az ujjaiból.

A reverz transzkriptáz katalizálja az RNS cDNS-vé való átalakulását.Mind az M-MLV, mind az AMV endogén RNázH ​​aktivitással rendelkezik a saját polimeráz aktivitásuk mellett.Az RNázH-aktivitás és a polimeráz-aktivitás verseng egymással az RNS-templát és a DNS-láncindító vagy cDNS-kiterjesztési szál között kialakuló hibrid szálért, és lebontja az RNS-szálat az RNS:DNS komplexben.Az RNázH-aktivitás által lebontott RNS-templát már nem szolgálhat hatékony szubsztrátként a cDNS-szintézishez, ami csökkenti a cDNS-szintézis hozamát és hosszát.Ezért előnyös lenne a reverz transzkriptáz RNázH ​​aktivitásának megszüntetése vagy nagymértékű csökkentése.

A SuperScript Ⅱ reverz transzkriptáz, az RNaseH-MMLV reverz transzkriptáz és a thermoScript reverz transzkriptáz, az RNaseH-AMV több mennyiségben és több teljes hosszúságú cDNS-t tud nyerni, mint az MMLV és az AMV.Az RT-PCR érzékenységet a cDNS szintézis mennyisége befolyásolja.A ThermoScript sokkal érzékenyebb, mint az AMV.Az RT-PCR termékek méretét korlátozza a reverz transzkriptáz cDNS-szintetizáló képessége, különösen nagyobb cDNS-ek klónozása esetén.Az MMLV-vel összehasonlítva a SuperScripⅡ jelentősen megnövelte a hosszú RT-PCR termékek hozamát.Az RNázH-reverz transzkriptáz fokozott hőstabilitású, így a reakció a normál 37-42°C-nál magasabb hőmérsékleten is végrehajtható.A javasolt szintézis körülmények között használjon oligo(dT) primert és 10 μCi [α-P]dCTP-t.Az első szál összhozamát TCA precipitációs módszerrel számítottuk ki.A teljes hosszúságú cDNS-t elemeztük méret szerint válogatva, kimetszett és lúgos agarózgélen megszámoltuk.

3. Emelje meg az inkubációs hőmérsékletet a fordított transzkripcióhoz:

A magasabb inkubációs hőmérséklet elősegíti az RNS másodlagos szerkezetének megnyitását, növelve a reakció hozamát.A legtöbb RNS-templát esetében az RNS és a primerek 65 °C-on történő inkubálása puffer vagy só nélkül, majd gyors hűtés jégen megszünteti a legtöbb másodlagos szerkezetet, és lehetővé teszi a primerek kötődését.Néhány sablonnak azonban még mindig vannak másodlagos szerkezetei, még hődenaturáció után is.Ezeknek a nehéz sablonoknak az amplifikációja végrehajtható ThermoScript Reverse Transcriptase használatával, és a reverz transzkripciós reakciót magasabb hőmérsékletre helyezve az amplifikáció javítása érdekében.Magasabb inkubációs hőmérséklet is növelheti a specificitást, különösen, ha génspecifikus primereket (GSP) használnak a cDNS szintézishez (lásd a 3. fejezetet).Ha GSP-t használ, győződjön meg arról, hogy a primerek Tm-je megegyezik a várható inkubációs hőmérséklettel.Ne használjon oligo(dT) és random primereket 60°C felett.A véletlenszerű primereket 25 °C-on 10 percig kell inkubálni, mielőtt 60 °C-ra emelnék.Amellett, hogy magasabb reverz transzkripciós hőmérsékletet használunk, a specificitás úgy is javítható, hogy az RNS/primer keveréket közvetlenül a 65°C-os denaturációs hőmérsékletről a fordított transzkripciós inkubációs hőmérsékletre visszük át, és előmelegített 2× reakcióelegyet adunk hozzá (cDNS hot-start szintézis).Ez a megközelítés segít megelőzni az alacsonyabb hőmérsékleten előforduló intermolekuláris bázispárosodást.Az RT-PCR-hez szükséges többszörös hőmérséklet-kapcsolás leegyszerűsíthető egy hőciklus használatával.

A Tth hőstabil polimeráz Mg2+ jelenlétében DNS polimerázként, Mn2+ jelenlétében RNS polimerázként működik.Legfeljebb 65°C-on melegen tartható.Azonban a Mn2+ jelenléte a PCR során csökkenti a pontosságot, ami miatt a Tth polimeráz kevésbé alkalmas nagy pontosságú amplifikációra, például cDNS klónozására.Ezenkívül a Tth alacsony reverz transzkripciós hatékonysággal rendelkezik, ami csökkenti az érzékenységet, és mivel a reverz transzkripció és a PCR egyetlen enzimmel is végrehajtható, a reverz transzkripció nélküli kontroll reakciók nem használhatók a cDNS amplifikációs termékek és a szennyező genomi DNS összehasonlítására.Az amplifikációs termékeket elválasztottuk.

4. A fordított transzkripciót elősegítő adalékok:

Adalékanyagokat, köztük glicerint és DMSO-t adnak az első szál szintézis reakciójához, ami csökkentheti a nukleinsav kettős szálának stabilitását és feloldhatja az RNS másodlagos szerkezetét.Legfeljebb 20% glicerint vagy 10% DMSO-t lehet hozzáadni a SuperScript II vagy MMLV aktivitás befolyásolása nélkül.Az AMV akár 20% glicerint is képes elviselni aktivitásvesztés nélkül.Az RT-PCR érzékenységének maximalizálása érdekében a SuperScriptⅡ reverz transzkripciós reakcióban 10% glicerint adhatunk hozzá, és 45 °C-on inkubálhatjuk.Ha a reverz transzkripciós reakciótermék 1/10-ét hozzáadjuk a PCR-hez, akkor az amplifikációs reakcióban a glicerin koncentrációja 0,4%, ami nem elegendő a PCR gátlásához.

5. RNázH ​​kezelés:

A cDNS-szintézis reakciók RNázH-val történő kezelése a PCR előtt növelheti az érzékenységet.Egyes templátok esetében úgy gondolják, hogy a cDNS szintézis reakciójában az RNS megakadályozza az amplifikációs termékek kötődését, amely esetben az RNázH ​​kezelés növelheti az érzékenységet.Általában az RNázH-kezelés szükséges hosszabb, teljes hosszúságú cDNS-céltemplátok amplifikálásakor, mint például az alacsony kópiaszámú gumós scherosis II.Ennél a nehéz templátnál az RNaseH kezelés fokozta a SuperScript II vagy az AMV által szintetizált cDNS által termelt jelet.A legtöbb RT-PCR reakció esetében az RNázH ​​kezelés opcionális, mivel a PCR denaturálási lépés 95 °C-on általában hidrolizálja az RNS:DNS komplexben lévő RNS-t.

6. A kis RNS kimutatási módszer fejlesztése:

Az RT-PCR különösen nagy kihívást jelent, ha csak kis mennyiségű RNS áll rendelkezésre.Az RNS izolálás során hordozóként hozzáadott glikogén segít a kis minták hozamának növelésében.RNáz-mentes glikogén adagolható a Trizol hozzáadásával egy időben.A glikogén vízoldható, és RNS-sel együtt a vizes fázisban tartható, hogy elősegítse a későbbi kicsapódást.Az 50 mg-nál kevesebb szövetet vagy 106 tenyésztett sejtet tartalmazó minták esetén az RNáz-mentes glikogén ajánlott koncentrációja 250 μg/ml.

Ha acetilált BSA-t adunk a fordított transzkripciós reakcióhoz a SuperScript II használatával, az növelheti az érzékenységet, kis mennyiségű RNS esetén pedig a SuperScript II mennyiségének csökkentése és 40 egység RNaseOut nukleáz inhibitor hozzáadása növelheti a detektálás szintjét.Ha glikogént használnak az RNS izolálási folyamatban, továbbra is javasolt BSA vagy RNáz inhibitor hozzáadása a SuperScript II reverz transzkripciós reakcióhoz.

、Növelje az RT-PCR specifitását

1. CND-szintézis:

Az első szálú cDNS szintézis három különböző módszerrel indítható meg, amelyek relatív specificitása befolyásolja a szintetizált cDNS mennyiségét és típusát.

A random primer módszer volt a legkevésbé specifikus a három módszer közül.A primerek a transzkriptum során több helyen kapcsolódnak össze, rövid, részleges hosszúságú cDNS-eket hozva létre.Ezt a módszert gyakran használják 5'-végi szekvenciák előállítására és cDNS kinyerésére olyan másodlagos szerkezetű régiókkal vagy terminációs helyekkel rendelkező RNS-templátokból, amelyek reverz transzkriptázzal nem replikálhatók.A leghosszabb cDNS eléréséhez empirikusan meg kell határozni a primerek RNS-hez viszonyított arányát minden RNS-mintában.A random primerek kiindulási koncentrációja 50-250 ng/20 μl reakció volt.Mivel a teljes RNS-ből véletlenszerű primerekkel szintetizált cDNS elsősorban riboszómális RNS, templátként általában poli(A)+RNS-t választanak.

Az Oligo(dT) primerek specifikusabbak, mint a random primerek.Hibridizálódik a legtöbb eukarióta mRNS 3'-végén található poli(A) farokkal.Mivel a poli(A)+ RNS a teljes RNS körülbelül 1-2%-át teszi ki, a cDNS mennyisége és komplexitása sokkal kisebb, mint a véletlenszerű primereknél.Magas specificitása miatt az oligo(dT) általában nem igényli az RNS és a primerek arányának optimalizálását és a poli(A)+ szelekciót.20 μl reakciórendszerenként 0,5 μg oligo(dT) használata javasolt.az oligo(dT)12-18 a legtöbb RT-PCR-hez alkalmas.A ThermoScript RT-PCR rendszer az oligo(dT)20-at kínálja, mivel jobb termikus stabilitása magasabb inkubációs hőmérséklet esetén.

A génspecifikus primerek (GSP) a legspecifikusabb primerek a reverz transzkripciós lépéshez.A GSP egy antiszensz oligonukleotid, amely specifikusan képes hibridizálni az RNS célszekvenciájához, ellentétben a random primerekkel vagy az oligo(dT)-vel, amelyek az összes RNS-hez kapcsolódnak.A reverz transzkripciós reakciókban a GSP tervezésére ugyanazok a szabályok vonatkoznak, mint a PCR primerek tervezésénél.A GSP lehet ugyanaz a szekvenciája, mint az amplifikációs primer, amely az mRNS 3'-legszélső végéhez kapcsolódik, vagy a GSP megtervezhető úgy, hogy a reverz amplifikációs primertől lefelé csatlakozik.Egyes amplifikált alanyok esetében egynél több antiszensz primert kell megtervezni a sikeres RT-PCR-hez, mivel a cél-RNS másodlagos szerkezete megakadályozhatja a primer kötődését.20 μl-es elsőszálú szintézis reakcióban 1 pmol antiszensz GSP használata javasolt.

2. Emelje meg az inkubációs hőmérsékletet a fordított transzkripcióhoz:

A GSP-specifitás előnyeinek teljes kihasználása érdekében nagyobb hőstabilitású reverz transzkriptázt kell használni.A hőstabil reverz transzkriptázok magasabb hőmérsékleten inkubálhatók a reakció szigorúságának növelése érdekében.Például, ha egy GSP 55 °C-on lágyul, a GSP specifitása nem lesz teljes mértékben kihasználva, ha AMV-t vagy M-MLV-t használnak a reverz transzkripcióhoz alacsony, 37 °C-os szigorúság mellett.A SuperScript II és a ThermoScript azonban 50°C-on vagy magasabb hőmérsékleten is reagáltatható, ami kiküszöböli az alacsonyabb hőmérsékleten keletkező nem specifikus termékeket.A maximális specifitás érdekében az RNS/primer keveréket a 65 °C-os denaturációs hőmérsékletről közvetlenül a reverz transzkripciós inkubációs hőmérsékletre vihetjük át, és hozzáadhatjuk egy előmelegített 2× reakciókeverékhez (cDNS szintézis melegindítás).Ez segít megelőzni az intermolekuláris bázispárosodást alacsony hőmérsékleten.Az RT-PCR-hez szükséges többszörös hőmérséklet-átmenetek leegyszerűsíthetők egy hőciklus használatával.

3. Csökkenti a genomi DNS-szennyeződést:

Az RT-PCR során felmerülő lehetséges nehézség a genomiális DNS szennyeződése az RNS-ben.Egy jó RNS izolálási módszer, például a Trizol Reagent alkalmazása csökkenti az RNS-készítményt szennyező genomiális DNS mennyiségét.A genomiális DNS-ből származó termékek elkerülése érdekében az RNS-t amplifikációs minőségű DNáz I-gyel lehet kezelni a szennyező DNS eltávolítására a reverz transzkripció előtt.A DNáz I emésztést úgy fejeztük be, hogy a mintákat 2,0 mM EDTA-ban 10 percig 65 °C-on inkubáltuk.Az EDTA magnéziumionokat kelátizálhat, megakadályozva a magnéziumion-függő RNS hidrolízisét magas hőmérsékleten.

Az amplifikált cDNS és a szennyező genomiális DNS-amplifikációs termékek elválasztása érdekében primereket lehet tervezni, amelyek mindegyike külön exonokhoz kapcsolódik.A cDNS-ből származó PCR-termékek rövidebbek, mint a szennyezett genomiális DNS-ből származó termékek.Ezenkívül minden RNS-templáton reverz transzkripció nélküli kontrollkísérletet végeztünk annak meghatározására, hogy egy adott fragmentum genomi DNS-ből vagy cDNS-ből származik-e.A reverz transzkripció nélkül kapott PCR-termék a genomból származik.