Ⅰ. Növelje a reakciórendszer érzékenységét:

1. Külön jó minőségű RNS:

A sikeres cDNS-szintézis kiváló minőségű RNS-ből származik.A jó minőségű RNS-nek legalább teljes hosszabbat kell biztosítania, és nem tartalmaz olyan inhibitorokat, amelyek nem tartalmaznak rögzítő enzimeket, például EDTA-t vagy SDS-t.Az RNS minősége határozza meg a cDNS-re átírható szekvencia információ maximális értékét.Az általános RNS-tisztítási módszer izoocianát/acidofenol alkalmazásának lépéses módszere.Az RNáz szennyeződésének megelőzése érdekében az RNázban gazdag mintából (például a hasnyálmirigyből) leválasztott RNS formaldehid tárolását igényli a jó minőségű RNS megmentése érdekében, ami még inkább a hosszú távú tároláshoz szükséges.A patkánymájból kivont RNS alapvetően lebomlott egy hét vízben való tárolás után, míg a patkány lépből extrahált RNS stabil maradt három év vízben való tárolás után.Ezenkívül a 4 kb-nál nagyobb átiratok érzékenyebbek az RNáz lebomlására, mint a kis átiratok.A tároló RNS-minta stabilitásának növelése érdekében az RNS-t feloldhatjuk egy ion-metalmaminban, és -70 °C-on tároljuk.Az RNS mentésére használt tilid nem tartalmazhat olyan különféle tárgyat, amely lebontja az RNS-t.A hasnyálmirigyből származó RNS legalább egy évig megtakarítható a metalmaminban.Ha készen áll az RNS használatára, a következő módszereket használhatja az RNS kicsapására: adjon hozzá NaCl-t 0,2 m térfogatú és 4-szeres térfogatú etanolhoz, helyezze szobahőmérsékletre 3-5 percig, és 10 000 × g centrifugálással 5 percig.

2. Használjon RNázH-aktivitás nélküli reverz transzkriptázt (RNaseH-)

RNáz inhibitorokat gyakran adnak a reverz transzkripciós reakciókhoz, hogy növeljék a cDNS szintézis hosszát és hozamát.Az RNáz inhibitort az első láncszintézis-reakcióban adják hozzá pufferek és redukálószerek, például DTT jelenlétében, mivel a pre-cDNS szintézis folyamat denaturálja az inhibitort, ezáltal felszabadítja az RNS-t lebontó kötött RNázokat.A fehérje RNáz inhibitor csak az RNáz A, B, C általi lebomlását akadályozza meg, és nem akadályozza meg az RNázok bőrre jutását, ezért ügyelni kell arra, hogy az RNázok ne kerüljenek be az ujjakból ezen inhibitorok használata ellenére.

A reverz transzkriptáz katalizálja az RNS cDNS-vé való átalakulását.Mind az M-MLV, mind az AMV endogén RNázH ​​aktivitással rendelkezik a saját polimeráz aktivitásuk mellett.Az RNázH ​​aktivitás verseng a polimeráz aktivitással az RNS templátok és DNS primerek vagy cDNS kiterjesztésű szálak között kialakuló heterozigóta szálakért, és lebontja az RNS: RNS szálakat a DNS komplexekben.Az RNázH-aktivitás által lebontott RNS-templátok többé nem használhatók hatékony szubsztrátként a cDNS-szintézishez, ami csökkenti a cDNS-szintézis hozamát és hosszát.Így a reverz transzkriptáz RNázH-aktivitásának megszüntetése vagy nagymértékű csökkentése nagy előnyt jelentene.

A SuperScriptⅡ reverz transzkriptáz, az RNaseH MMLV reverz transzkriptáza és a thermoScript reverz transzkriptáz, az RNaseH AMV több teljes hosszúságú cDNS-t eredményezett, mint az MMLV és az AMV.Az RT-PCR érzékenységét befolyásolja a szintetizált cDNS mennyisége.A ThermoScript sokkal érzékenyebb, mint az AMV.Az RT-PCR termékek méretét korlátozza a reverz transzkriptáz azon képessége, hogy képes cDNS-t szintetizálni, különösen nagyobb CD-k klónozása esetén.Az MMLV-vel összehasonlítva a SuperScripⅡ jelentősen megnövelte a hosszú RT-PCR termékek hozamát.Az RNaseH- reverz transzkriptáza a termikus stabilitást is növeli, így a reakció a normálisnál magasabb, 37-42 ℃ hőmérsékleten is végrehajtható.A javasolt szintézis körülmények között oligo(dT) primereket és 10μCi [alpha-p]dCTP-t használtunk.Az első lánc teljes termelését TCA precipitációs módszerrel számítottuk ki.A teljes hosszúságú cDNS-t lúgos agarózgélben méret szerinti csíkeltávolítással és számlálással analizáltuk.

3. Növelje a fordított transzkripció hőmegőrzési hőmérsékletét:

A magasabb tartási hőmérséklet elősegíti az RNS másodlagos szerkezetének megnyitását és növeli a reakció hozamát.A legtöbb RNS-templát esetében, ha az RNS-t és a primert 65 °C-on tartjuk puffer vagy só nélkül, majd gyorsan jégen lehűtjük, a legtöbb másodlagos struktúra megszűnik, és lehetővé teszi a primerek kötődését.Néhány sablon azonban még termikus denaturáció után is rendelkezik másodlagos szerkezettel.Ezeknek a nehéz sablonoknak az amplifikálása végrehajtható ThermoScript reverz transzkriptáz segítségével, és a reverz transzkriptáz reakciójának magasabb hőmérsékletre helyezésével az amplifikáció javítása érdekében.A magasabb tartási hőmérséklet szintén növelheti a specificitást, különösen, ha a cDNS szintézist génspecifikus primerek (GSPS) segítségével hajtják végre (lásd a 3. fejezetet).GSP használata esetén ügyeljen arra, hogy a primer Tm értéke megegyezzen a várható tartási hőmérséklettel.Ne használjon oligo(dT) és random primereket 60 ℃ felett.A véletlenszerű primereket 25 °C-on kell tartani 10 percig, mielőtt 60 °C-ra növelnék.Amellett, hogy magasabb reverz transzkripciós hőmérsékleteket alkalmazunk, a specificitás javítható az RNS/primer keverék közvetlen átvitelével a 65 ℃-os denaturációs hőmérsékletről a reverz transzkripció tartási hőmérsékletére, és egy előmelegített 2× reakcióelegy hozzáadásával (cDNS termikus iniciációs szintézis).Ez a megközelítés segít megelőzni az alacsonyabb hőmérsékleten előforduló intermolekuláris bázispárosodást.A PCR-műszer használata leegyszerűsíti az RT-PCR-hez szükséges számos hőmérséklet-kapcsolót.

A Tth hőstabilizált polimeráz DNS polimerázként működik Mg2+ és RNS polimerázként Mn2+ jelenlétében.Akár 65 ℃-ig képes hőt tartani.Azonban a Mn2+ jelenléte a PCR során csökkenti a pontosságot, ami miatt a Tth polimeráz kevésbé alkalmas nagy pontosságú amplifikációra, például cDNS klónozásra.Ezenkívül a Tth kevésbé hatékony a reverz transzkripcióban, ami csökkenti az érzékenységet, és mivel egyetlen enzim képes reverz transzkripciót és PCR-t végrehajtani, a reverz transzkripció nélküli kontroll reakciók nem használhatók a cDNS amplifikált termékeinek megkülönböztetésére a szennyezett genomiális DNS termékeitől.

4. Reverz transzkripciót elősegítő adalék:

Adalékanyagok, köztük glicerin és DMSO hozzáadása az első láncszintézis reakcióhoz csökkentheti a nukleinsav kettős szál stabilitását és feltekerheti az RNS másodlagos szerkezetét.Legfeljebb 20% glicerint vagy 10% DMSO-t lehet hozzáadni a SuperScriptⅡ vagy MMLV aktivitásának befolyásolása nélkül.Az AMV akár 20% glicerint is képes elviselni anélkül, hogy csökkentené az aktivitást.Az RT-PCR érzékenységének maximalizálása érdekében a SuperScriptⅡ reverz transzkripciós reakcióban 10% glicerint adhatunk hozzá, és 45 ℃-on szigetelhetjük.Ha a retrotranszkripciós reakció termékének 1/10-ét hozzáadjuk a PCR-hez, akkor az amplifikációs reakcióban a glicerin koncentrációja 0,4%, ami nem elegendő a PCR gátlásához.

5. RNaseH feldolgozás:

Az érzékenység javítható, ha a cDNS szintézis reakcióit RNázH-val kezeljük a PCR előtt.Egyes templátok esetében úgy gondolják, hogy a cDNS szintézis reakciójában az RNS megakadályozza az amplifikált termékek kötődését, amely esetben az RNázH ​​kezelés növelheti az érzékenységet.Általában RNázH-kezelés szükséges egy viszonylag hosszú, teljes hosszúságú cDNS-céltemplát amplifikálásához, mint például a gumós scherosisⅡ alacsony kópiaszámmal.Ennél a bonyolult sablonnál az RNaseH fokozta a SuperScriptⅡ vagy AMV által szintetizált cDNS által generált jelet.A legtöbb RT-PCR reakció esetében az RNázH ​​kezelés opcionális, mivel a 95 °C-os szigetelt PCR denaturációs lépés jellemzően hidrolizálja az RNS-t az RNS: DNS komplexből.

6. Továbbfejlesztett módszerek kis mennyiségű RNS kimutatására:

Az RT-PCR különösen nagy kihívást jelent, ha csak kis mennyiségű RNS áll rendelkezésre.A glikogén hordozóként történő hozzáadása az RNS-elválasztás során elősegíti a kis minták hozamának növelését.A Trizollal egyidejűleg RNáz-mentes glikogén is adható hozzá.A glikogén vízoldható, és az RNS-sel együtt a vízfázisban maradhat, hogy segítse a későbbi kicsapódást.Az RNáz-mentes glikogén ajánlott koncentrációja 250 μg/ml 50 mg-nál kevesebb szövetből vagy 106 tenyésztett sejtből álló minták esetén.

Az acetilált BSA hozzáadása a fordított transzkripciós reakciókhoz SuperScriptⅡ használatával növelheti az érzékenységet, kis mennyiségű RNS esetén pedig a SuperScriptⅡ mennyiségének csökkentése és 40 egység RnaseOut nukleáz inhibitor hozzáadása javíthatja az észlelési szintet.Ha glikogént használnak az RNS-elválasztáshoz, továbbra is javasolt BSA- vagy RNáz-gátlók hozzáadása a SuperScriptⅡ-t használó reverz transzkripciós reakciókhoz.

Ⅱ. Növelje az RT-PCR specificitását

1. cNDA szintézis:

Három különböző módszer használható az első szál cDNS szintézisének elindítására, és az egyes módszerek relatív specificitása befolyásolja a szintetizált cDNS mennyiségét és típusát.

A véletlenszerű primer módszer a legkevésbé specifikus a három módszer közül.A láncindítókat a transzkriptum során több helyen összekapcsolják, hogy rövid, részleges hosszúságú cDNS-t állítsanak elő.Ezt a módszert gyakran használják 5'-terminális szekvenciák és cDNS előállítására olyan RNS-templátokból, amelyek másodlagos szerkezeti régiói vagy olyan terminációs helyei vannak, amelyek a reverz transzkriptáz nem replikálódnak.A leghosszabb cDNS eléréséhez empirikusan meg kell határozni a primerek RNS-hez viszonyított arányát minden RNS-mintában.A random primerek kezdeti koncentrációja 50-250 ng/20 μl reakciórendszer.Mivel a teljes RNS-ből véletlenszerű primerekkel szintetizált cDNS főként riboszomális RNS, templátként általában poli(A)+RNS-t választanak.

Az oligo(dT) iniciáció specifikusabb, mint a random primerek.A legtöbb eukarióta sejtben az mRNS 3'-végén található poli(A) farokkal hibridizálódik.Mivel a poli(A)+RNS a teljes RNS nagyjából 1-2%-át teszi ki, a cDNS mennyisége és komplexitása sokkal kisebb, mint véletlenszerű primerek alkalmazása esetén.Magas specificitása miatt az oligo(dT) általában nem igényel optimalizálást az RNS/primer arány és a poli(A)+ szelekció szempontjából.20 μl reakciórendszerenként 0,5 μg oligo(dT) használata javasolt.az oligo(dT)12-18 a legtöbb RT-PCR-hez alkalmas.A ThermoScript RT-PCR rendszer jó hőstabilitása miatt oligo(dT)20-at biztosít, és alkalmas magasabb tartási hőmérsékletre.

A génspecifikus primerek (GSP) a legjobb specifikus primerek a reverz transzkripciós lépéshez.A GSP egy antiszensz oligonukleozid, amely specifikusan tud hibridizálni az RNS rendeltetési szekvenciáival, ahelyett, hogy az összes RNS-t, például véletlenszerű primereket vagy oligo(dT) összekapcsolná.A PCR primerek tervezésénél alkalmazott szabályok vonatkoznak a reverz transzkripciós reakció GSP tervezésére is.A GSP lehet ugyanaz a szekvencia, mint az mRNS3' végén összekapcsolt amplifikációs primer, vagy a GSP megtervezhető úgy, hogy a reverz amplifikációs primerrel lefelé kapcsolódjon.Egyes amplifikált objektumok esetében egynél több antiszensz primer tervezése szükséges a sikeres RT-PCR-hez, mivel a cél-RNS másodlagos szerkezete megakadályozhatja a primer kötődését.Az első 20μl-es láncszintézis reakciórendszerben 1 pmol antiszensz GSP használata javasolt.

2. Növelje a fordított transzkripció hőmegőrzési hőmérsékletét:

A GSP-specifitás teljes kihasználása érdekében nagy termikus stabilitású reverz transzkriptázt kell használni.A hőstabil reverz transzkriptáz magasabb hőmérsékleten szigetelhető a reakció szigorának növelése érdekében.Például, ha egy GSP-t 55 °C-on hőkezelnek, akkor a GSP specifitása nincs teljesen kihasználva, ha a reverz transzkripciót 37 °C-on, alacsony szigorral hajtják végre AMV vagy M-MLV használatával.A SuperScripⅡ és a ThermoScript azonban 50 ℃ vagy magasabb hőmérsékleten is reagálhat, ami kiküszöböli az alacsonyabb hőmérsékleten előállított nem specifikus termékeket.A maximális specifitás érdekében az RNS/primer keverék közvetlenül átvihető a 65°C-os denaturációs hőmérsékletről a reverz transzkripció tartási hőmérsékletére egy előmelegített 2x reakcióelegy hozzáadásával (a cDNS-szintézis termikus iniciálása).Ez segít megelőzni a molekulák közötti bázispárosodást alacsony hőmérsékleten.A PCR-műszer használata leegyszerűsíti az RT-PCR-hez szükséges számos hőmérséklet-átmenetet.

3. Csökkentse a genomi DNS-szennyeződést:

Az RT-PCR egyik lehetséges nehézsége az, hogy az RNS szennyezi a genomiális DNS-t.A jobb RNS-elválasztási módszerek, például a Trizol Reagent alkalmazása csökkenti a genomi DNS-szennyeződést az RNS-készítményekben.A genomiális DNS-ből származó termékek elkerülése érdekében az RNS-t amplifikációs minőségű DnasⅠ-vel lehet kezelni, hogy a reverz transzkripció előtt eltávolítsuk a szennyezett DNS-t.A mintákat 65 °C-on 2,0 mM EDTA-ban tartottuk 10 percig, hogy befejezzük a DNázⅠ emésztést.Az EDTA magnéziumionokat kelátizál, hogy megakadályozza a magnézium-ion-függő RNS hidrolízist, amely magas hőmérsékleten megy végbe.

Az amplifikált cDNS és a genom DNS-amplifikációs termék elválasztása érdekében olyan primerek tervezhetők, amelyek külön kapcsolódnak az elválasztott exonhoz.A cDNS-ből származó PCR-termékek rövidebbek, mint a szennyezett genomiális DNS-ből származó termékek.Reverz transzkripció nélküli ellenőrzött kísérletet is végeznek minden RNS-templáton annak meghatározására, hogy egy adott fragmentum genomi DNS-ből vagy cDNS-ből származik-e.A reverz transzkripció hiányában kapott PCR-termékek a genomból származnak.

Kapcsolódó termék

RT-PCR Easy^ᵀᴹÉn (Egy lépés)

- Az egylépéses készlet lehetővé teszi a reverz transzkripció és a PCR végrehajtását ugyanabban a csőben.Csak templát RNS-t, specifikus PCR primereket és RNáz-mentes ddH-t kell hozzáadnia.₂O.

- Az RNS valós idejű kvantitatív elemzése gyorsan és pontosan elvégezhető.

-A készlet egyedi Foregene reverz transzkripciós reagenst és Foregene HotStar Taq DNS polimerázt használ, egyedi reakciórendszerrel kombinálva, hogy hatékonyan javítsa az amplifikációs hatékonyságot és a reakció specifitását.

- Az optimalizált reakciórendszernek köszönhetően a reakció nagyobb érzékelési érzékenységgel, erősebb termikus stabilitással és jobb toleranciával rendelkezik.

RT Easy II (GDNázzal) Master Premix első szálú CDNA szintézishez valós idejű PCR-hez GDNázzal

- Hatékony gDNS eltávolítási képesség, amely 2 percen belül képes eltávolítani a gDNS-t a sablonból.

- Hatékony reverz transzkripciós rendszer, mindössze 15 percet vesz igénybe az első szál cDNS szintézise.

- Összetett sablonok: a magas GC tartalmú és összetett másodlagos szerkezetű sablonok is nagy hatékonysággal visszafordíthatók.

-Nagy érzékenységű reverz transzkripciós rendszer, pg-szintű templátok is kaphatnak kiváló minőségű cDNS-t.

-A reverz transzkripciós rendszer nagy termikus stabilitással rendelkezik, az optimális reakcióhőmérséklet 42 ℃, és még mindig jó a fordított transzkripciós teljesítménye 50 ℃-on.