1. Alapvető ismeretek (ha a kísérleti részt szeretné látni, kérjük, tegye át közvetlenül a második részbe)
A hagyományos PCR derivált reakciójaként a Real Time PCR elsősorban a PCR amplifikációs reakció egyes ciklusaiban az amplifikációs termék mennyiségének változását figyeli valós időben a fluoreszcencia jel változásán keresztül, és kvantitatívan elemzi a kiindulási templátot a ct érték és a standard görbe kapcsolatán keresztül.
Az RT-PCR specifikus adatai a következőkalapvonal, fluoreszcencia küszöbésCt érték.
| alapvonal: | A 3-15. ciklus fluoreszcencia értéke az alapvonal (alapvonal), amelyet a mérés alkalmi hibája okoz. |
| Küszöb (küszöb): | Az amplifikációs görbe exponenciális növekedési tartományának megfelelő pozíciójában beállított fluoreszcencia kimutatási határértékre vonatkozik, amely általában az alapvonal szórásának tízszerese. |
| CT érték: | A PCR-ciklusok száma, amikor a fluoreszcencia értéke az egyes reakciócsövekben eléri a küszöbértéket. A Ct érték fordítottan arányos a kezdeti sablon mennyiségével. |
Az RT-PCR általános jelölési módszerei:
| módszer | előny | hiányosság | hatály |
| SYBR zöldⅠ | Széleskörű alkalmazhatóság, érzékeny, olcsó és kényelmes | A primer követelmények magasak, hajlamosak a nem specifikus sávokra | Alkalmas különféle célgének kvantitatív elemzésére, génexpresszió kutatására, valamint transzgenikus rekombináns állatok és növények kutatására. |
| TaqMan | Jó specifitás és nagy ismételhetőség | Az ár magas, és csak meghatározott célokra alkalmas. | Kórokozók kimutatása, gyógyszerrezisztencia génkutatás, gyógyszerhatékonyság felmérés, genetikai betegségek diagnosztikája. |
| molekuláris jeladó | Magas specificitás, fluoreszcencia, alacsony háttér | Az ára magas, csak meghatározott célra alkalmas, a tervezés nehézkes, az ára magas. | Specifikus génanalízis, SNP analízis |
2. Kísérleti lépések
2.1 A kísérleti csoportosításról- több kútnak kell lennie a csoportban, és biológiai ismétlődéseknek kell lenniük.
| ① | Üres vezérlő | A sejtek növekedési állapotának kimutatására használják kísérletekben |
| ② | Negatív kontroll siRNS (nem specifikus siRNS szekvencia) | Mutassa be az RNSi hatás specifitását.Az siRNS nem specifikus stresszválaszt indukálhat 200 nM koncentrációban. |
| ③ | Transzfekciós reagens kontroll | Ki kell zárni a transzfekciós reagens sejtekre gyakorolt toxicitását vagy a célgén expressziójára gyakorolt hatást |
| ④ | siRNS a célgén ellen | Döntse le a célgén expresszióját |
| ⑤ (nem kötelező) | pozitív siRNS | Kísérleti rendszer- és működési problémák hibaelhárítására szolgál |
| ⑥ (nem kötelező) | Fluoreszcens kontroll siRNS | A sejttranszfekció hatékonysága mikroszkóppal figyelhető meg |
2.2 Az alapozó tervezés elvei
| Felerősített fragmensméret | Lehetőleg 100-150 bp |
| Alapozó hossza | 18-25 bp |
| GC tartalom | 30-70%, lehetőleg 45-55% |
| Tm érték | 58-60 ℃ |
| Sorrend | Kerülje a folyamatos T/C-t;A/G folyamatos |
| 3 végsorozat | Kerülje a GC gazdag vagy AT gazdag;a terminális alap előnyösen G vagy C;legjobb elkerülni a T |
| Komplementaritás | Kerülje el a 3-nál több bázisból álló komplementer szekvenciákat a primeren belül vagy két primer között |
| Specifikusság | Használja a blast keresést a primer specifikusságának megerősítéséhez |
①A SiRNS fajspecifikus, és a különböző fajok szekvenciái eltérőek lesznek.
②A SiRNS fagyasztva szárított porba van csomagolva, amely szobahőmérsékleten 2-4 hétig stabilan tárolható.
2.3 Eszközök vagy reagensek, amelyeket előre el kell készíteni
| Primer (belső referencia) | Köztük kettő előre és hátra |
| Primerek (célgén) | Köztük kettő előre és hátra |
| Cél Si RNS (3 csík) | Általában a vállalat 3 csíkot szintetizál, majd RT-PCR segítségével kiválaszt egyet a három közül. |
| Transzfekciós készlet | Lipo2000 stb. |
| RNA Rapid Extraction Kit | Transzfekció utáni RNS extrakcióhoz |
| Rapid Reverse Transcription Kit | cDNS szintézishez |
| PCR amplifikációs készlet | 2×Super SYBR zöld qPCR Master Mix |
2.4 Ami a konkrét kísérleti lépések során figyelmet érdemlő kérdéseket illeti:
①siRNS transzfekciós folyamat
1. A lemezezéshez választhat 24-lyukú lemezt, 12-lyukú lemezt vagy 6-lyukú lemezt (a javasolt átlagos RNS-koncentráció egy 24-lyukú lemez minden egyes lyukájában körülbelül 100-300 ng/uL), és a sejtek optimális transzfekciós sűrűsége körülbelül 60-80%
2. A transzfekció lépései és a speciális követelmények szigorúan összhangban vannak az utasításokkal.
3. A transzfekciót követően 24-72 órán belül mintákat lehet gyűjteni mRNS kimutatáshoz (RT-PCR) vagy fehérje kimutatáshoz 48-96 órán belül (WB)
② RNS extrakciós folyamat
1. Akadályozza meg az exogén enzimekkel való szennyeződést.Ez főleg a maszk és kesztyű szigorú viselését foglalja magában;sterilizált pipettahegyek és EP-csövek használata;a kísérletben használt víznek RNáz-mentesnek kell lennie.
2. Javasoljuk a gyors extrakciós készletben javasolt kétszeri elkészítését, ami valóban javítja a tisztaságot és a hozamot.
3. A hulladékfolyadék nem érheti az RNS oszlopot.
③ RNS mennyiségi meghatározása
Az RNS extrahálása után közvetlenül Nanodrop segítségével mennyiségileg meghatározható, és a minimális leolvasás akár 10 ng/ul is lehet.
④ Fordított átírási folyamat
1. Az RT-qPCR nagy érzékenysége miatt minden mintához legalább 3 párhuzamos mérőhelyet kell készíteni, nehogy a következő Ct túlságosan eltérő legyen, vagy az SD ne legyen túl nagy a statisztikai elemzéshez.
2. Ne fagyassza le és ne olvassa fel ismételten a Master mixet.
3. Minden csövet/lyukat új hegyre kell cserélni!Ne használja folyamatosan ugyanazt a pipettahegyet a minták hozzáadásához!
4. A minta hozzáadása után a 96 lyukú lemezre rögzített filmet lemezzel kell simítani.A legjobb, ha a gépre helyezés előtt centrifugálja, hogy a cső falán lévő folyadék le tudjon folyni és eltávolítsa a légbuborékokat.
⑤ Közös görbe elemzés
| Nincs logaritmikus növekedési periódus | Lehetséges, hogy magas a sablonkoncentráció |
| Nincs CT érték | Helytelen lépések a fluoreszcens jelek észleléséhez; primerek vagy próbák lebomlása – integritása PAGE elektroforézissel kimutatható; elégtelen mennyiségű sablon; a sablonok lebomlása – a szennyeződések bejutásának és az ismételt fagyasztás és felengedés elkerülése a minta-előkészítés során; |
| Ct>38 | Alacsony erősítési hatékonyság;A PCR termék túl hosszú;különböző reakciókomponensek lebomlanak |
| Lineáris erősítési görbe | A szondák részlegesen leépülhetnek ismételt fagyasztási-olvadási ciklusok vagy hosszan tartó fény hatására |
| Különösen nagy a különbség a duplikált lyukak között | A reakcióoldat nem olvad meg teljesen, vagy a reakcióoldat nem keveredik össze;a PCR műszer termálfürdője fluoreszcens anyagokkal szennyezett |
2.5 Az adatelemzésről
A qPCR adatelemzése relatív és abszolút kvantifikációra osztható.Például a kezelt csoport sejtjei összehasonlítva a kontrollcsoport sejtjeivel,
Hányszor változik az X gén mRNS-e, ez relatív mennyiségi meghatározás;bizonyos számú sejtben az X gén mRNS-e
Hány példány van, ez abszolút számszerűsítés.Általában a legtöbbet a relatív mennyiségi módszert alkalmazzuk a laboratóriumban.Általában,a 2-ΔΔct módszerkísérletekben használják a legtöbbet, ezért itt csak ezt a módszert mutatjuk be részletesen.
2-ΔΔct módszer: A kapott eredmény a kísérleti csoportban a célgén expressziójának különbsége a kontrollcsoportban lévő célgénhez viszonyítva.Előírás, hogy mind a célgén, mind a belső referenciagén amplifikációs hatékonysága közel 100%, és a relatív eltérés nem haladhatja meg az 5%-ot.
A számítási módszer a következő:
Δct kontrollcsoport = a célgén ct értéke a kontrollcsoportban – a belső referenciagén ct értéke a kontrollcsoportban
Δct kísérleti csoport = a célgén ct értéke a kísérleti csoportban – a belső referenciagén ct értéke a kísérleti csoportban
ΔΔct=Δct kísérleti csoport-Δct kontrollcsoport
Végül számítsa ki a kifejezési szint különbségének többszörösét:
Fold=2-ΔΔct módosítása (az excel függvénynek a POWER felel meg)
Kapcsolódó termékek:
Feladás időpontja: 2023. május 20
