Tippek a ragasztó visszanyerésének javításához

1. Növelje a mintaterhelést az elektroforézis során.

2. Használjon frissen készített elektroforézis puffert.

3. Ragasztó vágásakor próbálja csak a ragasztót csíkokkal vágni, hogy csökkentse a ragasztóvágás mennyiségét: ne kelljen ragasztóra kevés célú töredék, különben befolyásolja a visszanyerési sebességet.

4. Két vagy több ragasztódarab megolvasztása után használjon egy csövet, bármilyen nagy a térfogata, és vigye át ugyanabba az oszlopba.

5. A szolba adagolt oldat lehet egy kicsit több, ami jobban elősegíti a DNS kötődését a membránhoz, de általában nem haladja meg a 750 ul-t.

6. A gél visszanyerésének kulcsa az, hogy a DNS-t az oszlophoz kötjük az oldat sókoncentrációja, savassága (töltése) és hidrofóbsága révén.Ezért, ha az elektroforézis puffer pH-ja túl magas, 10 ul (pH 5,0, 3 mol/l NaAC) adható a szolhoz;a DNS-molekulák membránon való jobb elfogása érdekében a ragasztó feloldása után 30% izopropanolt adhatunk a folyadékhoz, hogy melegítsük.

7. Az eluens hozzáadása előtt hagyja az oszlopot szobahőmérsékleten néhány percig (kb. 10 percig), hogy az etanol teljesen elpárologjon.

8. Végül adjon hozzá kevesebb eluenst a visszanyerési térfogat minimalizálása érdekében.Az elúcióhoz általában 30-50μl eluenst használnak (nem túl keveset, különben nem tudja nedvesíteni a membránt, ami nem kedvez az eluálásnak);az eluáló cseppek a membrán közepén vannak, hogy a membránhoz kötött DNS-t teljesen eluálják.

9. Az eluens hozzáadása után 55 fokos vízfürdőben 5 percig eluálható, vagy 10 percnél hosszabb időre 50 fokos vízfürdőbe helyezve, vagy éjszakára 4 fokon parafilmmel lezárva, majd másnapi visszanyerés céljából centrifugálva jó a hatása.

10.Adja vissza a centrifugált eluátumot az adszorpciós oszlophoz, és centrifugálja újra.

Részletes módszerek és eljárások a PCR termék kinyerésére

1. Rendes gumi újrahasznosítás

Ha vissza akarja állítani a ragasztót, a legjobb egy olyan készletet használni, amely kényelmes és valamivel magasabb visszanyerési arányú.Ha valóban manuálisan kell helyreállítania, a ragasztó levágása után a TE térfogatának háromszorosát is hozzáadhatja.Vízfürdőben történő megolvasztás után a fenolt, a fenol/kloroformot tisztán extraháljuk, és az etanolt kicsapjuk.Ez az.

2. DNS kinyerése alacsony olvadáspontú gélekből

DNS-fragmensek tisztítása Adjunk hozzá TE-t (10 mmol/l Tris-HCl pH 8,0, 0,1 mmol/l EDTA) a gél térfogatának megfelelő mennyiségben, és helyezzük 65 °C-os vízfürdőbe 5 percre, hogy a gél teljesen feloldódjon.

Szobahőmérsékletre hűtés után azonos mennyiségű fenolt (TE-vel telített, TE-t lezártunk a felső rétegbe, és az alsó fenolréteget eltávolítottuk) adtunk hozzá, majd óvatosan összekevertük (keverésre nincs szükség), és 12 000 fordulat/perc sebességgel 3 percig centrifugáltuk.Ismételje meg 1-2 alkalommal.

Vegyük a felülúszót, adjunk hozzá 0,1 térfogat 3 mol/l nátrium-acetátot (pH 5,2) és 2,5-szeres térfogatú abszolút etanolt az etanolos kicsapás végrehajtásához.Oldja fel a tisztított DNS-t megfelelő mennyiségű TE-vel, mérje meg a tartalmát, és készítse elő felhasználásra (felhasználható célgénszerkezet-elemzésre, próbakészítésre stb.).

3. PCR visszanyerés jó amplifikációs specificitással

Ha a PCR-amplifikáció specifitása jó, akkor ez csak a PCR-termék egyszerű tisztítása és kinyerése.Hozzáadhat 50 ug/ml proteináz K-t a PCR-termékhez, 37 fokon 1 órán át, egyszer extrahálhat fenollal/kloroformmal, egyszer extrahálhat kloroformmal, és hozzáadhat 0,1 térfogatnyi felülúszót.A nátrium-acetátot 2,5 térfogat abszolút etanollal végzett kicsapással kinyerjük.

Kapcsolódó termékek:

https://www.foreivd.com/pcr-purification-kit-2-product/

https://www.foreivd.com/blood-superdirecttm-pcr-kit-edta-product/