A hagyományos reverz transzkriptázok nem tolerálják a magas hőmérsékletet (az MMLV aktivitásának optimális hőmérséklete 37-50 °C, az AMV pedig 42-60 °C).Az összetettebb vírus RNS alacsony hőmérsékleten nem írható le hatékonyan cDNS-vé, ami detektálási hatékonyságot eredményez.A hagyományos RT-qPCR általában két kulcsenzim (reverz transzkriptáz és DNS polimeráz) részvételét igényli, ami lehetetlenné teszi a reakciórendszer működésének egyszerűsítését és a költségek csökkentését.Itt bemutatunk két magas hőmérsékletnek ellenálló reverz transzkriptázt, a TtH-t és a RevTaq-ot.Ez a két enzim DNS-polimeráz funkciót is ellát, ezért bifunkcionális enzimeknek nevezzük.

TtH DNS polimeráz

Biztosan hallott már a TtH-ról, amely a Thermus thermophilus HB8 termofil baktériumból származik.Kétértékű kationok, például Mg2+ jelenlétében DNS-polimeráz aktivitással rendelkezik.Széles körben alkalmazzák PCR-reakciókban, mint például a Taq enzim, de hőállósága nagyobb, mint a Taq enzim, így a magas GC tartalmú templátokkal a PCR-re is jobban hat.

· Ennek az enzimnek alapvetően nincs 3′→5′ exonukleáz és 5′→3′ exonukleáz aktivitása, így didezoxiszekvenálásra is használható.

· Ez az enzim RTáz aktivitással rendelkezik.Mn2+ jelenlétében az RTáz aktivitás fokozódik.Ennek a funkciónak a segítségével reverz transzkripciós reakció és PCR reakció hajtható végre ugyanabban a csőben, azaz egylépéses RT-PCR.Mn2+ jelenlétében azonban az RT-PCR pontossága nem magas.Az RT aktivitásnak semmi köze az rnáz H aktivitáshoz.

· A Tth-DNS polimeráz megnövekedett aktivitása (pH9, optimális +55℃～+70℃, maximum +95℃) áthidalja az RNS másodlagos szerkezetéből adódó problémákat.A kapott cDNS PCR-rel amplifikálható ugyanazzal az enzimmel Mg2+ ionok jelenlétében.

· A Tth-DNS polimeráz azon képessége, hogy magas hőmérsékleten reverz transzkripciót és DNS-amplifikációt hajt végre, hasznossá teszi ezt az enzimet a sejtes és vírusos RNS kvantitatív RT-PCR-ében, klónozásában és génexpressziós elemzésében.
· A Tth-DNS polimerázt RT-PCR-hez használják az RNS amplifikálására 1 kb-ig.

Jellemzők és előnyök

Tth DNS polimeráz:

• Biztosítsa az optimalizált polimeráz láncreakció (PCR) termékméretet, legalább 1000 bp-t az RT-PCR reakcióban

• Fogadja el szubsztrátként módosított dezoxiribonukleozid-trifoszfátot

• Nem kapcsolódik az RNáz H aktivitáshoz

• Magas termikus stabilitással rendelkezik a problémák leküzdésére, amelyek általában az RNS-ben jelenlévő magas másodlagos szerkezettel kapcsolatosak

RevTaq RT-PCR DNS polimeráz

Hőálló DNS polimeráz reverz transzkriptáz aktivitással

A RevTaq-RT-PCR-DNS polimeráz egy mesterségesen kialakított, rendkívül hőálló, kettős funkciójú enzim, reverz transzkriptáz és DNS-polimeráz aktivitással, amelyet irányított és mesterséges evolúcióval nyernek.

· A RevTaq RT-PCR DNS polimeráz felezési ideje 95°C-on meghaladja a 40 percet.

· A RevTaq RT-PCR DNS polimeráz lehetővé teszi a magas hőmérsékletű reverz transzkripciót közvetlenül az RNS-templátról, és a reverz transzkripciós lépés többször is megismételhető több cDNS-templát létrehozása érdekében.

· A RevTaq RT-PCR DNS polimeráz lehetővé teszi a „zéró lépéses” RT-PCR-t (nincs izoterm reverz transzkripciós lépés), mivel a ciklikus PCR kiterjesztési lépésben a reverz transzkripció és a DNS-amplifikáció egyszerre megy végbe.Ez a reverz transzkripciós reakciót is elősegíti magas hőmérsékleten, ezáltal minimalizálva az RNS erős másodlagos szerkezetének magas hőmérsékleten történő megolvasztásakor felmerülő problémákat.

· Az aptamer alapú hot-start formulának köszönhetően a RevTaq RT-PCR DNS polimeráz jobb eredményeket produkál, ha az annealing és extenzió hőmérséklete magasabb, mint 57°C.

· Mivel az enzim hőálló, nagyon magas (>60°C) olvadáspontú primerek és szondák tervezése javasolt.

· Javasoljuk, hogy a reakcióbeállítási folyamat során a lágyítási/nyújtási lépés hőmérsékletét hőmérséklet-gradiensen keresztül optimalizálják.

· Minél magasabb a hőmérséklet, annál nagyobb a PCR specificitása.A reverz transzkripciós ciklust általában magasabb hőmérsékleten hajtják végre, mint a PCR ciklust, mivel a DNS Primer:RNS templát hibridizáció általában magasabb olvadásponttal rendelkezik, mint a DNS Primer:cDNS templát duplex.

· A RevTaq RT-PCR DNS polimeráz genetikailag módosított és optimalizált, az amplikon mérete 60-300 bp.

A RevTaq RT-PCR DNS polimeráz kimutatási határa eléri a 4 kópiát/

Az optimalizált reakciórendszer (magas olvadáspontú primerek létrehozása) az ábrán látható.A RevTaq RT-PCR DNS polimeráz által vezérelt RT-PCR jobb érzékenységet mutat, mint a TaqPath 1-lépéses RT-qPCR master mix, és alacsonyabb kimutatási mintahígítási gradienst mutat.

További előnyök:

Gyorsindítás funkció → A kezdeti termikus denaturálási lépés kihagyható.

Hot-start aptamer formula → Azonnal 100%-os enzimaktivitást biztosít, és alacsony hőmérsékleten (<57°C) megakadályozza a nem specifikus amplifikációt.

Hasítási funkció → Az RNS extrakciós lépést kihagyjuk, mert a RevTaq RT-PCR DNS polimeráz nyers reakciómintákat is képes feldolgozni.Azonnal elpusztíthatja az eukarióták, baktériumok és vírusok sejtmembránjait egy forró RT-PCR ciklusban.

IVD alapanyag szint → magas minőségi szabványok és rendkívül versenyképes árak