Az RNáz érzékeny szó, amelyet sok olyan diák, aki gyakran végez RNS-kivonási kísérleteket, nem akar hallani.A teljesen felfegyverzett RNS, amelyet végül a rendkívül mérgező fenol és kloroform reagensekkel extraháltak, lebomlott.Nem vagyok kibékülve!!!Ma vessünk egy pillantást a híres Rnase eredetére.

A ribonukleáz (RNáz) vagy RNáz egy nukleáz, amely az RNS-t kis molekulákká hidrolizálja.Az RNáz kis molekulájú fehérjeként szokatlanul stabil .A hagyományos magas hőmérsékletű és nagynyomású gőzsterilizálás és fehérjeinhibitorok nem tudják teljesen inaktiválni.Az RNáz stabilitása elsősorban a szerkezetben lévő diszulfid kötésekből származik.Például a szarvasmarha hasnyálmirigyének általánosan használt RNáza csak 124 aminosavból áll, de 4 diszulfidkötést tartalmaz.A kénkötés és a diszulfidkötés kiváló termikus stabilitással ruházza fel az RNázt.Ezenkívül az rnáz viszonylag kis molekulatömegű, és sok esetben gyorsan vissza tudja állítani eredeti konformációját.

Amellett, hogy rendkívül stabil,Az RNázok mindenütt jelen vannak a laboratóriumban .Az RNáz egy biológiai védekező mechanizmus.Egy sejt számára az exogén RNS gyakran végzetes.Az exogén DNS-hez képest az exogén RNS gyakran veszélyesebb.Az RNS boldogan íródik át és fordítódik le, így szinte minden szervezetben RNázok fejlődtek ki, hogy megvédjék magukat az exogén RNS inváziója ellen.Ezért a laboratóriumban tenyésztett baktériumsejtek és Önök, akik RNS-t extrahálnak, az RNáz aromáját árasztják.Az emberi testnedvek (nyál, könnyek stb.) nagy mennyiségű RNázt tartalmaznak, ezért ne sírj, ha az RNS lebomlik.Minél többet sírsz, annál rosszabb az RNS lebomlása!!Daiyu nővér nem alkalmas RNS-kinyerésre!

Emellett az érzékeny bőröd is sok RNázt tartalmaz, és a bőrrel érintett markerek, pipetták, hűtőszekrényajtók és kilincsek is tartalmaznak RNázt.

Ennyi kósza szóval nézzük meg, hogyan kezeljük az RNázokat.

Az első dolog, amire mindenki gondol az RNS eltávolításakorDEPC(dietil-pirokarbonát).A DEPC főként a hisztidin RNáz aktív csoportjának imidazolgyűrűjével kombinálva denaturálja a fehérjét, ezáltal gátolja az enzim aktivitását.A 0,1%-os DEPC jobb eltávolító hatást fejthet ki az Rnase-ra, de ügyelnünk kell arra, hogy a DEPC ismert rákkeltő anyag, ezért alkalmazásakor különös figyelmet kell fordítani.

Az RNase esetében két szempontból kell kiindulnunk:az első az endogén RNáz aktivitásának gátlása

A Trizolban található hagyományos RNS extrakciós reagensek, mint például a guanidin-izotiocianát és a DTT, fel tudják nyitni az RNáz diszulfidkötését, de még mindig vannak RNázok, különösen a szövetmintákban, ezért ügyeljen az alacsony hőmérsékletre.

1.Azonnal merítse a szövetmintát folyékony nitrogénbe, miután kivette, vagy egy kereskedelemben kapható RNS konzerváló oldatba.

2.A sejtminta RNS-ének extrahálása után adjuk hozzá a lízisoldathoz, és lizáljuk a jégszekrényen

3. Az őrléshez legjobb folyékony nitrogént használni amikor a szövetminták homogenizálódnak.Folyékony nitrogén nélküli elektromos homogenizátor használatakor ügyeljen a homogenizáló adapter teljes előhűtésére.

A második az exogén DNS-áz

1.Legyen teljesen felfegyverkezve, viseljen laborköpenyt, maszkot, és mindenképpen vegyen fel egy pár új kesztyűt (ne legyetek olyan takarékosak!! Figyelembe kell venni, hogy a Trizol szuper maró hatású, ráadásul kesztyűn keresztül is nagyon erős, szóval ne csöpögjön a kezére).

2.Az összes használt pipettahegyet, EP-csövet, PCR-csövet és egyéb berendezést RNáz-mentesíteni kell.0,1%-os DEPC-be áztatható, majd nagy nyomás alatt nyomás alá helyezhető.Ügyeljen a füstelszívóban való működésre.A helyi zsarnokok közvetlenül vásárolhatnak fogyóeszközöket az enzimek eltávolításához.

PS: Hadd mondjak el egy lusta módszert.Bár a magas hőmérséklet és a magas nyomás nem tudja teljesen eltávolítani az RNázt, eltávolítja annak nagy részét.A 2-szeres magas hőmérséklet és nagy nyomás jó hatással van, az RNS kinyerésének pedig kevés hatása van.

3.Az alkohol denaturálhatja a fehérjéket,így az RNS extrakciós asztal 75%-os alkohollal letörölhető , és a kesztyűt is lefújhatjuk alkohollal.

4.A végső RNS-oldó oldatot és a centrifugacsövet szintén RNáz-mentesíteni kell.A DEPC víz egy általánosan használt RNS-oldó oldat.Beszéljünk a DEPC víz megfelelő elkészítési módjáról (a vásárláskor ne felejtse el újracsomagolni a DEPC-t)

Adjunk DEPC-t az ultratiszta vízhez 1:1000 arányban, rázzuk fel jól, hagyjuk állni egy éjszakán át 37 °C-on, majd sterilizáljuk 121 °C-on magas hőmérsékleten és nagy nyomáson 15 percig.A DEPC víz -20°C-on 1 ml-es aliquot részekben tárolható.

Végül összefoglalva: az alacsony hőmérséklet a kulcs, a fogyóeszközök jól kezelhetők, teljesen fel van fegyverezve és kevesebb beszéd!

Nos, ennyi a mai stratégia.Az általad említett RNS-koncentrációt és tisztaságot kívánom.Mindkét A260/A280 2.0!!!

Természetesen, ha aszobahőmérsékleten működő RNS extrakciós készlet, előfordulhat, hogy nem találkozik a fenti bajokkal.

Szobahőmérsékleten végzett művelet DNáz hozzáadása nélkül 11 perc alatt kivonja a sejtekből a teljes RNS-t, az állati szövetekből vagy növényekből pedig 30 perc alatt kivonja a teljes RNS-t.

Próbamintákért forduljon:overseas@foregene.com

Kapcsolódó termékek:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/