A fluoreszcenciás kvantitatív PCR (más néven TaqMan PCR, a továbbiakban FQ-PCR) egy új nukleinsav-kvantitatív technológia, amelyet a PE (Perkin Elmer) fejlesztett ki 1995-ben az Egyesült Államokban. Ez a technológia a hagyományos PCR-en alapul, fluoreszcensen jelölt próbák hozzáadásával.A rugalmas PCR-hez képest az FQ-PCR számos előnnyel rendelkezik a kvantitatív funkciójának megvalósításához.Ez a cikk a technológia jellemzőit, elveit, módszereit és alkalmazásait kívánja röviden ismertetni.
1 Jellemzők
Az FQ-PCR nemcsak a közönséges PCR nagy érzékenységével rendelkezik, hanem a fluoreszcens szondák alkalmazása miatt a fotoelektromos vezetési rendszeren keresztül közvetlenül képes detektálni a fluoreszcens jel változását a PCR amplifikáció során, így kvantitatív eredményeket kap, ami a hagyományos PCR számos hiányosságát kiküszöböli, így a DNS hibridizációs technológia magas specifitásával és magas spektrumú hibridizációjával is rendelkezik.
Például az általános PCR-termékeket agaróz gélelektroforézissel és ultraibolya fénnyel történő etídium-bromidos festéssel vagy poliakrilamid gélelektroforézissel és ezüstfestéssel kell megfigyelni.Ez nemcsak több eszközt igényel, hanem időt és erőfeszítést is igényel.A használt etidium-bromid foltok károsak az emberi szervezetre, és ezek a bonyolult kísérleti eljárások lehetőséget adnak a környezetszennyezésre és a hamis pozitív eredményekre.Az FQ-PCR-nek azonban csak egyszer kell kinyitnia a fedelet a mintabetöltés során, és az ezt követő folyamat teljesen zárt csöves működés, amely nem igényel PCR utófeldolgozást, így elkerülhető a hagyományos PCR műveletek számos hátránya.A kísérlet általában a PE cég által kifejlesztett ABI7100 PCR termikus ciklust használja.
A műszer a következő jellemzőkkel rendelkezik: ① Széleskörű alkalmazás: Használható DNS és RNS PCR termékek mennyiségi meghatározására, génexpressziós kutatásra, kórokozók kimutatására és a PCR körülményeinek optimalizálására.② Egyedülálló mennyiségi elv: Fluoreszcensen jelölt szondák használatával a fluoreszcencia mennyisége a lézeres gerjesztést követően a PCR-ciklussal felhalmozódik, hogy elérje a mennyiségi meghatározás célját.③ Magas működési hatékonyság: Beépített 9600 PCR hőciklus, számítógép által vezérelt 1-2 óra, hogy 96 minta amplifikációja és mennyiségi meghatározása automatikusan és szinkronban befejeződjön.④ Nincs szükség gélelektroforézisre: Nincs szükség a minta hígítására és elektroforézisére, csak használjon speciális szondát, hogy közvetlenül a reakciócsőben észlelje.⑤ Nincs szennyezés a csővezetékben: Az egyedülálló, teljesen zárt reakciócsövet és a fotoelektromos vezetési rendszert alkalmazzák, így nem kell aggódnia a szennyezés miatt.⑥Az eredmények reprodukálhatók: a kvantitatív dinamikatartomány legfeljebb öt nagyságrendig terjedhet.Ezért, mióta ezt a technológiát sikeresen kifejlesztették, számos tudományos kutató nagyra értékelte, és számos területen alkalmazták.
2 Alapelvek és módszerek
Az FQ-PCR működési elve az, hogy a Taq enzim 5′→3′ exonukleáz aktivitását felhasználva fluoreszcensen jelölt szondát adunk a PCR reakciórendszerhez.A próba specifikusan hibridizálhat a primer szekvenciában található DNS-templáttal.A próba 5' vége a FAM fluoreszcencia emissziós génnel van jelölve (6-karboxifluoreszcein, fluoreszcencia emissziós csúcs 518 nm-en), a 3' vége pedig a TAMRA fluoreszcencia kioltó csoportja (6-carboxytetramethylrhodamine, thebe ginning 2 fluorescence) foszforilálva van, hogy megakadályozza a próba meghosszabbodását a PCR-amplifikáció során.Amikor a próba érintetlen marad, a kioltó csoport elnyomja a kibocsátó csoport fluoreszcens emisszióját.Miután az emittáló csoportot elválasztják a kioltó csoporttól, a gátlás megszűnik, és az 518 nm-es optikai sűrűség megnő, és a fluoreszcencia-detektáló rendszer érzékeli. A renaturációs fázisban a próba hibridizálódik a templát DNS-sel, és a kiterjesztési fázisban lévő Taq enzim a DNS templát mentén mozog a primer kiterjesztésével.Amikor a szondát levágják, a kioltó hatás megszűnik, és a fluoreszcens jel felszabadul.Minden alkalommal, amikor a sablont másolják, egy szondát levágnak, és egy fluoreszcens jel felszabadul.Mivel egy az egyhez kapcsolat van a felszabaduló fluoroforok száma és a PCR-termékek száma között, ez a technika használható a templát pontos mennyiségi meghatározására.A kísérleti műszer általában a PE cég által kifejlesztett ABI7100 PCR termikus ciklust használja, és más termikus ciklusok is használhatók.Ha a kísérlethez az ABI7700 reakciótípusú reakciórendszert használjuk, a reakció lezajlása után a kvantitatív eredmények számítógépes elemzéssel közvetlenül megadhatók.Ha más hőciklust használ, akkor fluoreszcencia detektort kell használnia a reakciócsőben lévő fluoreszcencia jel egyidejű mérésére az RQ+, RQ-, △RQ kiszámításához.Az RQ+ a mintacső fluoreszcens emissziós csoportja lumineszcencia intenzitásának és a kioltócsoport lumineszcencia intenzitásának arányát jelöli, RQ- a kettő arányát jelenti a vak csőben, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) a CR fluoreszcencia adatfeldolgozás után kapott kvantitatív adatváltozások mennyiségét.A fluoreszcens próbák bevezetésének köszönhetően a kísérlet specificitása jelentősen javul.A próba kialakításának általában meg kell felelnie a következő feltételeknek: ①A szonda hosszának körülbelül 20-40 bázisnak kell lennie a kötődés specifitásának biztosítása érdekében.②A GC-bázisok tartalma 40% és 60% között van, hogy elkerüljük az egyetlen nukleotid szekvenciák megkettőzését.③ Kerülje a hibridizációt vagy a primerekkel való átfedést.④ A próba és a templát közötti kötődés stabilitása nagyobb, mint a primer és a templát közötti kötődés stabilitása, ezért a próba Tm értékének legalább 5°C-kal magasabbnak kell lennie, mint a primer Tm értékénél.Ezenkívül a próba koncentrációja, a próba és a templát szekvencia közötti homológia, valamint a próba és a primer közötti távolság egyaránt hatással van a kísérleti eredményekre.
Kapcsolódó termékek:
Kína Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman gyártó és szállító |Foregene (foreivd.com)
Feladás időpontja: 2021.10.15
