Az észlelés sajátossága
A legtöbb esetben a primer tervezésének célja a PCR specifitásának maximalizálása.Ezt számos változó többé-kevésbé megjósolható hatása határozza meg.Az egyik fontos változó a szekvencia a primer 3′ végén.
Fontos, hogy a specifitásra tervezett PCR-vizsgálatok nagyobb valószínűséggel tartanak fenn magas hatékonyságot széles dinamikus tartományban, mivel az assay nem termel nem specifikus amplifikációs termékeket, ezáltal versenyeznek a PCR-reagensekkel, vagy gátolják a fő amplifikációs reakciót.
Természetesen bizonyos esetekben nem a specifitás a legfontosabb, például amikor a közeli rokon, de eltérő kórokozók számszerűsítése a cél, speciális tervezési, optimalizálási és verifikációs szabványok szükségesek.
Az olvadási görbe egy standard módszer az amplikonok specifitásának értékelésére, legalábbis abból a szempontból, hogy amplifikálni kell-e egyetlen célpontot.Ugyanakkor hangsúlyozni kell, hogy az olvadási görbék félrevezetőek lehetnek, mert például a szuboptimális primerek és az alacsony templátkoncentrációk együttes hatásai befolyásolhatják őket.
P5 |Az olvadási görbe két különböző mennyiségű cél-DNS két kimutatásából származó Tm eltolódást mutatja.
V. Magasabb koncentrációknál (ad) a qPCR mérés befejezése után nincs nyilvánvaló primer dimer.Ahogy a templátkoncentráció 50 másolatra csökken (e), egy nem specifikus termék kezd megjelenni, és ez lesz az egyetlen termék a legalacsonyabb koncentrációban (f).
B. A teszt ugyanazt a Tms-t rögzítette minden célkoncentrációnál, és még a legalacsonyabb koncentrációnál sem volt nyilvánvaló primer dimer (5 kópia).E két kimutatási módszer alkalmazásakor nem volt kimutatható amplifikációs termék az NTC-ben.
A P5 az olyan minták kioldódási görbéit mutatja, amelyekben a templát különböző koncentrációkban van jelen.A P 5a azt mutatja, hogy a két legalacsonyabb koncentrációnál az előállított nem specifikus amplifikációs termékek Tms-ei alacsonyabbak, mint a specifikus amplikonoké.
Nyilvánvaló, hogy ez a kimutatási módszer nem használható megbízhatóan alacsony koncentrációban létező célpontok kimutatására.
Érdekes módon az NTC-k, azaz a DNS-t nem tartalmazó minták nem rögzítettek (nem specifikus) amplifikációs termékeket, ami arra utal, hogy a háttér genomiális DNS részt vehet a nem specifikus amplifikációban/polimerizációban.
Néha az ilyen háttérprimerek és a nem specifikus amplifikáció nem orvosolható, de gyakran lehetséges olyan kimutatási módszer megtervezése, amely semmilyen templátkoncentrációban és NTC-ben nem rendelkezik aspecifikus amplifikációval (P 5b).
Itt még a célkoncentráció amplifikációjának 35-ös Cq-val történő rögzítése is specifikus kioldódási görbét eredményez.Hasonlóképpen, az NTC-k nem mutatták a nem specifikus amplifikáció jeleit.Előfordulhat, hogy a detektálási viselkedés az anyalúgtól függ, és bizonyos pufferkészítményekben csak nem specifikus amplifikáció mutatható ki, ami összefüggésben lehet a különböző Mg2+-koncentrációkkal.
Az észlelés stabilitása
A Ta optimalizálása hasznos lépés a qPCR detektálás empirikus verifikációs és optimalizálási folyamatában.Közvetlen jelzést ad a primerkészlet robusztusságáról azáltal, hogy megmutatja azt a hőmérsékletet (vagy hőmérséklet-tartományt), amely a legalacsonyabb Cq-t produkálja az NTC erősítése nélkül.
Az érzékenység két-négyszeres különbsége nem feltétlenül fontos a magas mRNS-expressziójú emberek számára, de a diagnosztikai teszteknél a pozitív és a hamis negatív eredmények közötti különbséget jelentheti.
A qPCR primerek Ta tulajdonságai nagymértékben változhatnak.Egyes tesztek nem túl robusztusak, és ha nem a primerek optimális Ta-értéke alatt hajtják végre őket, akkor gyorsan összeomlanak.
Ez azért fontos, mert az ilyen típusú kimutatás gyakran problémás a való világban, és a minta tisztasága, a DNS koncentrációja vagy más DNS jelenléte nem feltétlenül optimális.
Ezenkívül a célmásolatszám széles tartományban változhat, és a reagensek, műanyag edények vagy műszerek eltérhetnek a teszt beállításakor használtaktól.
P6|A hőmérsékleti gradiens a PCR kimutatás eltérő robusztusságát mutatja.
A. Használja a Bioline Sensifast SYBR mastermix-et (katalógusszám: BIO-98050) emberi agy RNS-ből előállított cDNS PCR végrehajtásához.
B. Használja a Bio-Rad CFX qPCR műszerét az apalén amplifikációs térképének és kioldódási görbéjének rögzítéséhez (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).
C. Az ACSBG1 amplifikációs grafikonja és olvadási görbéje (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. A GFAP amplifikációs grafikonja és kioldódási görbéje (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).
E. Különböző lágyítási hőmérsékleteken mért Cq-k, amelyek a 7 C-os hőmérsékleti gradiens alatt mért Cq különbséget mutatják.
A P 6 egy nemkívánatos teszt tipikus eredményét mutatja, ahol a qPCR-t 59C és 67C közötti Tas gradienssel (P 6a) végezték, három emberi agy-specifikus gén primereivel.
Az amplifikációs grafikonon látható, hogy az Opalin primerek távolról sem ideálisak, mert az optimális Ta tartományuk nagyon szűk (6b ábra), vagyis a Cq-k széles körben el vannak szóródva, ami azt eredményezi, hogy a Cqs szignifikánsan összehasonlítható az optimális Cqs Low értékükkel.
Ez a kimutatási módszer instabil, és szuboptimális erősítéshez vezethet.Ezért ezt az alapozópárt újra kell tervezni.Emellett az olvadási görbe elemzés (inset) azt mutatja, hogy ennek a kimutatási módszernek a specifitása is problémás lehet, mert az egyes Ta olvadási görbéje eltérő.
A P 6c-ben bemutatott ACSBG1 kimutatási módszer robusztusabb, mint a fenti Opalin detektálási módszer, de még mindig messze van az ideálistól, és valószínűleg javítható.
Hangsúlyozzuk azonban, hogy nincs szükségszerű kapcsolat a robusztusság és a specificitás között, mert az ezzel a kimutatási módszerrel előállított oldódási görbe minden Tasban (inset) ugyanazt a csúcsértéket mutatja.
Másrészt a robusztussági teszt sokkal toleránsabb, hasonló Cq-kat produkál a Tas széles tartományában, mint a P 6d-ben bemutatott GFAP teszt.
Az ugyanabban a 8 Celsius-fokos tartományban kapott Cqs különbség kisebb, mint 1, és az oldódási görbe (betét) megerősíti a detektálási jellemzőket ebben a hőmérséklet-tartományban.Érdemes megjegyezni, hogy a számított Tas és a tényleges Ta tartomány nagyon eltérő lehet.
Számos irányelv létezik, amelyek segítik a kutatókat a hatékony primerek megtervezésében, amelyek többsége régóta bevált szabályokon alapul, és nagy figyelmet fordítottak a primerek 3′végére.Gyakran javasoljuk, hogy a 3'-végen egy G-t vagy C-t és két G- vagy C-alapot (GC-bilincs) helyezzen el, de legfeljebb kettőt az utolsó 5 alapból.
A gyakorlatban ezek a szabályok irányíthatják a kutatókat, de nem feltétlenül helytállóak minden körülmények között.
P7 |A primer 3′vége kevés hatással van a specifitásra vagy a hatékonyságra.
A. A humán HIF-1α (NM_181054.2) gén primereinek helyzete.
B. Használjon Agilent Brilliant III SYBR Green anyalúgot (Kat. sz. 600882) hat tesztelem amplifikálására.
C. A Bio-Rad CFX qPCR műszerrel és 3'-end primerekkel rögzített amplifikációs grafikont és olvadási görbét.Az NTC-k piros színnel jelennek meg.
D. Cqs rekord minden vizsgálati tételhez
Például a P 7-ben kapott eredmény ellentmond a 3′end szabálynak.Minden terv alapvetően ugyanazt az eredményt adja, mindössze két primer kombináció vezet nem specifikus amplifikációhoz az NTC-ben.
A GC klip hatását azonban nem tudjuk támogatni, mert ebben az esetben az A vagy T maximum 30 bázisként való használata nem csökkenti a specificitást.
A C teszt, ahol az F primer GGCC-ben végződik, Cq-kat rögzített az NTC-kben, jelezve, hogy érdemes lehet elkerülni ezeket a szekvenciákat a 30-as végén.Hangsúlyozzuk, hogy a primerpár legjobb 3'-végi szekvenciája meghatározásának egyetlen módja néhány primerjelölt kísérleti értékelése.
Erősítés hatékonysága
Fontos, hogy bár a nem specifikus PCR-detektálás soha nem válhat specifikussá, az amplifikáció hatékonysága számos különböző módon beállítható és maximalizálható az enzim, az anyalúg, az adalékanyagok és a ciklus körülményeinek változtatásával.
A PCR-detektálás hatékonyságának értékeléséhez a legjobb a célnukleinsav 10-5-szörösének megfelelő sorozathígítás alkalmazása, azaz a „standard görbe módszer”.
Ha PCR-amplikonokat vagy szintetikus DNS-célpontokat használnak a standard görbe létrehozásához, akkor ezeknek a célpontoknak a sorozathígításait állandó mennyiségű háttér-DNS-sel (például genomiális DNS-sel) kell keverni.
P8 |Hígítási görbe a PCR hatékonyságának értékeléséhez.
A. Használjon primereket a HIF-1-hez: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA és R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC és Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (katalógusszám: 600882) a PCR és az olvadási görbe körülményeihez.
B. 100 ng RNS-t fordítottunk át, kétszer hígítottunk, és a sorozathígítású cDNS-mintákat ötször hígítottuk 1 ng humán genomi DNS-re.Az olvadási görbe a betéten látható.
C. Az RT reakciót, a hígítást és a sorozathígítást megismételtük a második cDNS-mintánál, és az eredmények hasonlóak voltak.
A P 8 két standard görbét mutat, ugyanazt a detektálási módszert alkalmazva két különböző cDNS mintán, az eredmény azonos hatásfok, kb. 100%, és az R2 érték is hasonló, vagyis a kísérleti adatok és a regressziós egyenes vagy az adatok közötti illeszkedés mértéke Linearitás foka.
A két standard görbe összehasonlítható, de nem teljesen ugyanaz.Ha a cél pontos számszerűsítése a cél, meg kell jegyezni, hogy elfogadhatatlan a példányszám számítása a bizonytalanság magyarázata nélkül.
P9 |A standard görbe segítségével történő kvantifikációhoz kapcsolódó mérési bizonytalanság.
A. Használjon primereket a GAPDH-hoz (NM_002046) a PCR és az olvadási görbe feltételeinek elvégzéséhez.F: ACAGTTGCCATGTAGACC és R: TAACTGGTTGAGCACAGG és a Bioline Sensifast SYBR mastermixe (katalógusszám: BIO-98050).
B. A Bio-Rad CFX qPCR műszerével rögzített amplifikációs diagram, olvadási görbe és standard görbe.
C. Standard görbe grafikon és 95%-os konfidencia intervallum (CI).
D. A hígítási görbéből származó három Cq-érték másolatszáma és 95%-os konfidencia intervalluma.
A P 9 azt mutatja, hogy egy optimalizált teszt esetén egyetlen standard görbe inherens variabilitása körülbelül 2-szeres (95%-os konfidencia intervallum, minimumtól maximumig), ami a legkisebb várható variabilitás lehet.
Kapcsolódó termék:
Animal Tissue Direct PCR készlet
Feladás időpontja: 2021-09-30
