Az RT-qPCR-t a szokásos PCR technológiából fejlesztették ki.Fluoreszcens vegyi anyagokat (fluoreszcens festékeket vagy fluoreszcens szondákat) ad hozzá a hagyományos PCR reakciórendszerhez, és valós időben érzékeli a PCR annealing és extenziós folyamatát a különböző lumineszcens mechanizmusoknak megfelelően.A fluoreszcens jel változásait a közegben a termékváltozás mértékének kiszámításához használjuk a PCR minden egyes ciklusában.Jelenleg a legelterjedtebb módszerek a fluoreszcens festék módszer és a szonda módszer.

Fluoreszcens festék módszer:
Egyes fluoreszcens festékek, mint például a SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO stb., önmagukban nem bocsátanak ki fényt, de fluoreszcenciát bocsátanak ki, miután a dsDNS kisebb barázdájához kötődnek.Ezért a PCR-reakció kezdetén a gép nem tudja érzékelni a fluoreszcens jelet.Amikor a reakció az annealing-extenziós (kétlépéses módszer) vagy extenziós szakaszba (háromlépéses módszer) megy, ekkor a kettős szálak felnyílnak, és az új DNS polimeráz A szálszintézis során a fluoreszcens molekulák egyesülnek a dsDNS minor barázdájában és fluoreszcenciát bocsátanak ki.A PCR-ciklusok számának növekedésével egyre több festék egyesül a dsDNS-sel, és a fluoreszcens jel is folyamatosan erősödik.Vegyük például a SYBR Green Ⅰ-t.
Szonda módszer:
A Taqman szonda a leggyakrabban használt hidrolízisszonda.A szonda 5′ végén egy fluoreszcens csoport található, általában FAM.Maga a próba a célgénnel komplementer szekvencia.A fluorofor 3′ végén egy fluoreszcens kioltócsoport található.A fluoreszcens rezonancia energiatranszfer (Förster resonance energy transfer, FRET) elve szerint, amikor a riporter fluoreszcens csoport (donor fluoreszcens molekula) és a kioltó fluoreszcens csoport (akceptor fluoreszcens molekula) Ha a gerjesztési spektrum átfedi egymást és a távolság nagyon közel van (7-10 nm) a donor fluoreszcens molekula elfogadóképessége ule, míg az autofluoreszcencia gyengül.Ezért a PCR-reakció elején, amikor a próba szabad és sértetlen a rendszerben, a riporter fluoreszcens csoport nem bocsát ki fluoreszcenciát.A lágyítás során a primer és a szonda a sablonhoz kötődik.A kiterjesztési szakaszban a polimeráz folyamatosan új láncokat szintetizál.A DNS polimeráz 5′-3′ exonukleáz aktivitással rendelkezik.Amikor eléri a próbát, a DNS-polimeráz hidrolizálja a próbát a templátról, elválasztja a riporter fluoreszcens csoportot a kioltó fluoreszcens csoporttól, és felszabadítja a fluoreszcens jelet.Mivel a próba és a sablon között egy az egyhez kapcsolat van, a próbamódszer a teszt pontosságát és érzékenységét tekintve felülmúlja a festékmódszert.

1. ábra A qRT-PCR elve

Primer design
Alapelvek:

A primereket a nukleinsavsorozat konzervált régiójában kell megtervezni, és specifitással kell rendelkezniük.

A legjobb a cDNS-szekvencia használata, és az mRNS-szekvencia is elfogadható.Ha nem, nézze meg a DNS-szekvencia cds régiójának kialakítását.
A fluoreszcens kvantitatív termék hossza 80-150 bp, a leghosszabb 300 bp, a primer hossza általában 17-25 bázis között van, és az upstream és a downstream primerek közötti különbség nem lehet túl nagy.

A G+C tartalom 40% és 60% között van, a 45-55% a legjobb.
A TM értéke 58-62 fok között van.
Igyekezzen kerülni a primer dimereket és öndimereket, (ne jelenjen meg több, mint 4 pár egymást követő komplementer bázis) hajtűszerkezet, ha elkerülhetetlen, akkor ΔG<4,5kJ/mol* Ha nem tudja biztosítani, hogy a gDNS a fordított transzkripció során eltávolítva lett Tiszta, akkor a legjobb a primerek tervezése a T, a módosított intron és a TC, endron nem lehet elkerülni *3 /C, A/G folytonos szerkezetű (2-3) primerek és nem
specifikus A heterogén módon amplifikált szekvencia homológiája előnyösen kevesebb, mint 70%, vagy 8 komplementer bázis homológiája van.
Adatbázis:
CottonFGD keresés kulcsszavak szerint
Primer design:
IDT-qPCR primer dizájn

2. ábra IDT online alapozó tervező eszköz oldal

Fig3 eredményoldal megjelenítése
LncRNS primerek tervezése:
lncRNS:ugyanazok a lépések, mint az mRNS.
miRNS:A stem-loop módszer elve: Mivel minden miRNS rövid, körülbelül 23 nt hosszúságú szekvencia, közvetlen PCR detektálás nem végezhető, ezért a stem-loop szekvencia eszközt használjuk.A szár-hurok szekvencia egy körülbelül 50 nt hosszúságú egyszálú DNS, amely önmagában hajtűszerkezetet tud alkotni.3 'A vége a miRNS parciális fragmentumával komplementer szekvenciaként tervezhető, majd a reverz transzkripció során a cél miRNS a szárhurok szekvenciához kapcsolható, és a teljes hossza elérheti a 70 bp-t, ami összhangban van az amplifikált termék qPCR-rel meghatározott hosszával.Tailing miRNS primer tervezés .
Erősítés-specifikus detektálás:
Online robbantási adatbázis: CottonFGD robbantás szekvencia hasonlóság alapján
Helyi blast: Tekintse meg a Blast+ használatát a helyi robbantáshoz, a linux és a macos közvetlenül létrehozhat egy helyi adatbázist, a win10 rendszer az ubuntu bash telepítése után is elvégezhető.Helyi blast adatbázis és helyi robbanás létrehozása;nyissa meg az ubuntu bash-t win10-en.
Megjegyzés: A hegyvidéki gyapot és a tengeri szigetek gyapotja tetraploid növények, így a robbantás eredménye gyakran két vagy több gyufa lesz.A múltban, ha NAU cd-ket használtak adatbázisként a robbantás végrehajtásához, valószínűleg két homológ gént találtak, amelyeknek csak néhány SNP-különbsége van.Általában a két homológ gént nem lehet primer tervezéssel elválasztani, ezért azonosként kezeljük őket.Ha nyilvánvaló indel van, a primert általában az indelre tervezik, de ez a primer másodlagos szerkezetéhez vezethet. A szabad energia megnő, ami az amplifikációs hatásfok csökkenéséhez vezet, de ez elkerülhetetlen.

Primer másodlagos szerkezetének kimutatása:
Lépések:oligo 7 megnyitása → beviteli sablonszekvencia → alablak bezárása → mentés → primer keresése a sablonon, a ctrl+D billentyűkombináció a primer hosszának beállításához → különféle másodlagos struktúrák elemzése, mint például öndimerizációs test, heterodimer, hajtű, mismatch stb. A 4. ábra utolsó két képe a primerek vizsgálati eredményei.Az elülső alapozó eredménye jó, nincs szembetűnő dimer és hajtűszerkezet, nincsenek folytonos komplementer bázisok, és a szabadenergia abszolút értéke 4,5 alatt van, míg a hátsó primer folyamatos A 6 bázis komplementer, a szabad energia pedig 8,8;emellett a 3′ végén megjelenik egy komolyabb dimer, és megjelenik egy 4 egymást követő bázisból álló dimer.Bár a szabad energia nem magas, a 3′ dimer Chl komolyan befolyásolhatja az amplifikációs specifitást és az amplifikációs hatékonyságot.Ezenkívül ellenőrizni kell a hajtűket, a heterodimereket és az eltéréseket.

3. ábra oligo7 detektálási eredmények
Erősítési hatékonyság kimutatása:
A PCR reakció amplifikációs hatékonysága komolyan befolyásolja a PCR eredményeket.A qRT-PCR-ben is az amplifikációs hatékonyság különösen fontos a kvantitatív eredmények szempontjából.Távolítson el más anyagokat, gépeket és protokollokat a reakciópufferből.A primerek minősége is nagyban befolyásolja a qRT-PCR amplifikációs hatékonyságát.Az eredmények pontosságának biztosítása érdekében mind a relatív fluoreszcencia kvantifikációnak, mind az abszolút fluoreszcencia kvantifikációnak ki kell mutatnia a primerek amplifikációs hatékonyságát.Felismerték, hogy a hatékony qRT-PCR amplifikációs hatékonyság 85% és 115% között van.Két módszer létezik:
1. Standard görbe módszer:
a.Keverjük össze a cDNS-t
b.Gradiens hígítás
c.qPCR
d.Lineáris regressziós egyenlet az erősítési hatékonyság kiszámításához
2. LinRegPCR
A LinRegPCR egy program a valós idejű RT-PCR adatok elemzésére, más néven kvantitatív PCR (qPCR) adatok SYBR Green vagy hasonló kémia alapján.A program nem kiindulási korrigált adatokat használ, minden egyes mintán külön-külön végrehajt egy alapvonal-korrekciót, meghatároz egy linearitási ablakot, majd lineáris regressziós elemzést használ, hogy egy egyenes vonalat illeszkedjen a PCR-adatkészletbe.Ennek az egyenesnek a meredekségéből számítjuk ki az egyes minták PCR hatékonyságát.Az amplikononkénti átlagos PCR-hatékonyságot és a mintánkénti Ct-értéket használják a mintánkénti kiindulási koncentráció kiszámításához, tetszőleges fluoreszcencia egységekben kifejezve.Az adatok bevitele és kiadása Excel-táblázaton keresztül történik.Csak minta
keverés szükséges, nincs gradiens
lépések szükségesek:(Vegyük például a Bole CFX96-ot, nem egészen a tiszta ABI-vel rendelkező gépet)
kísérlet:ez egy szabványos qPCR kísérlet.
qPCR adatkimenet:A LinRegPCR a kimeneti fájlok két formáját képes felismerni: RDML vagy kvantifikációs erősítési eredmény.Valójában ez a ciklusszám és a fluoreszcenciajel valós idejű detektálási értéke a gép által, és az erősítést a lineáris szegmens hatékonyságának fluoreszcencia változási értékének elemzésével kapjuk.
Adatok kiválasztása: Elméletileg az RDML értéknek használhatónak kell lennie.Becslések szerint a számítógépem problémája az, hogy a szoftver nem ismeri fel az RDML-t, ezért az excel kimeneti értéke az eredeti adat.Javasoljuk, hogy először végezzen durva szűrést az adatokon, mint például a minták hozzáadása sikertelensége, stb. A kimeneti adatokból a pontok törölhetők (természetesen nem törölheti őket, a LinRegPCR figyelmen kívül hagyja ezeket a pontokat a későbbiekben)

5. ábra qPCR adatexportálás

6. ábra jelölt minták kiválasztása

Adatbemenet:Nyissa meg a minősítési amplification results.xls fájlt, → nyissa meg a LinRegPCR-t → fájl → olvassa ki az excelből → válassza ki a paramétereket a 7. ábrán látható módon → OK → kattintson az alapvonalak meghatározása

7. ábra a linRegPCR adatbevitel lépései

Eredmény:Ha nincs ismétlés, nincs szükség csoportosításra.Ismétlődés esetén a mintacsoportosításban szerkeszthető a csoportosítás, és az azonosítóba beírjuk a gén nevét, majd automatikusan csoportosul ugyanaz a gén.Végül kattintson a fájlra, exportálja az Excelt, és tekintse meg az eredményeket.Megjelenik az egyes lyukak amplifikációs hatékonysága és R2 eredménye.Másodszor, ha csoportokra osztja, megjelenik a korrigált átlagos erősítési hatékonyság.Győződjön meg arról, hogy az egyes primerek amplifikációs hatékonysága 85% és 115% között van.Ha túl nagy vagy túl kicsi, az azt jelenti, hogy a primer amplifikációs hatékonysága gyenge.

8. ábra Eredmény és adatkimenet

Kísérleti folyamat:
RNS minőségi követelmények:
Tisztaság:1.7A 2,0 azt jelzi, hogy lehet maradék izotiocianát.Az A260/A230 tiszta nukleinsavnak 2 körül kell lennie. Ha 230 nm-en erős abszorpció van, az azt jelzi, hogy vannak szerves vegyületek, például fenátionok.Ezenkívül 1,5%-os agaróz gélelektroforézissel is kimutatható.Mutassuk meg a markert, mert az ssRNS-nek nincs denaturációja, és a molekulatömeg-logaritmusnak nincs lineáris kapcsolata, és a molekulatömeg nem fejezhető ki helyesen.Koncentráció: elméletilegnemkevesebb, mint 100 ng/ul, ha a koncentráció túl alacsony, a tisztaság általában alacsony, nem magas

9. ábra RNS gél

Ezen túlmenően, ha a minta értékes és az RNS-koncentrációja magas, ajánlatos az extrakció után aliquot részekre osztani, és az RNS-t 100-300 ng/ul végső koncentrációra hígítani a reverz transzkripcióhoz.Ban bena fordított transzkripció folyamata, amikor az mRNS átíródik, a reverz transzkripcióhoz olyan oligo (dt) primereket használnak, amelyek specifikusan kötődni tudnak a polyA farokhoz, míg az lncRNS és a circRNS véletlenszerű hexamer (Random 6 mer) primereket használ a teljes RNS reverz transzkripciójához.Sok cég mostanra dobott piacra speciális farokkészleteket.A szárhurok módszernél a farkoló módszer kényelmesebb, nagy áteresztőképességű és reagenstakarékosabb, de az azonos családba tartozó miRNS-ek megkülönböztetésének hatása nem lehet olyan jó, mint a szárhurok módszer.Minden reverz transzkripciós kitnek meg kell felelnie a génspecifikus primerek (szárhurkok) koncentrációjának.A miRNS-hez használt belső referencia az U6.A szár-hurkos inverzió során egy U6 csövet külön kell megfordítani, és közvetlenül hozzá kell adni az U6 első és hátsó alapozóját.Mind a circRNS, mind az lncRNS használhatja a HKG-ket belső referenciaként.Ban bencDNS kimutatás,
ha nincs probléma az RNS-sel, akkor a cDNS-nek is jónak kell lennie.Ha azonban a kísérlet tökéletességére törekszünk, a legjobb, ha egy belső referenciagént (Referenciagén, RG) használunk, amely képes megkülönböztetni a gDNS-t a cd-ktől.Általában az RG egy háztartási gén.HKG) a 10. ábrán látható módon;Akkoriban szójabab tároló fehérjét készítettem, és belső referenciaként aktin7-et tartalmazó intronokat használtam.E primer amplifikált fragmensének mérete a gDNS-ben 452 bp volt, és ha cDNS-t használtunk templátként, akkor 142 bp.Aztán a vizsgálati eredmények azt mutatták, hogy a cDNS egy része valóban gDNS-sel szennyezett, és azt is bebizonyította, hogy a reverz transzkripció eredményével nincs probléma, és templátként használható a PCR-hez.Az agaróz gél elektroforézist hiába futtatjuk közvetlenül cDNS-sel, és ez egy diffúz sáv, ami nem meggyőző.

10. ábra cDNS kimutatás

A qPCR feltételek meghatározásaA készlet protokollja szerint általában nincs probléma, főleg a tm érték lépésében.Ha egyes primereket nem megfelelően tervezték meg a primer tervezése során, ami nagy különbséget eredményez a tm érték és az elméleti 60 °C között, akkor javasolt a cDNS A minták összekeverése után végezzen gradiens PCR-t primerekkel, és próbálja meg elkerülni a sávok nélküli hőmérséklet beállítását TM értékként.

Adatelemzés

A hagyományos relatív fluoreszcencia kvantitatív PCR feldolgozási módszer alapvetően a 2-ΔΔCT.Adatfeldolgozási sablon.

Kapcsolódó termékek:

Valós idejű PCR egyszerű^TM – Taqman

Valós idejű PCR egyszerű^TM –SYBR GREEN I

RT Easy I (Master Premix az első szál cDNS szintéziséhez)

RT Easy II (Master Premix az első szál cDNS szintéziséhez qPCR-hez)