Alapozó tervezési alap (99% probléma megoldható)
1. Alapozó hossza: A tankönyv 15-30 bp-ot igényel, általában körülbelül 20 bp.A tényleges állapot jobb, ha 18-24 bp a specificitás biztosítása érdekében, de minél hosszabb, annál jobb, a túl hosszú primer is csökkenti a specificitást, és csökkenti a hozamot.
2. Primer amplifikációs tartomány: 200-500 bp a megfelelő, és a fragmens meghatározott körülmények között 10 kb-ra bővíthető.
3. Primer bázis: A G+C tartalma 40-60% legyen, a túl kicsi G+C amplifikációs hatás nem jó, túl sok G+C könnyen megjelenhet nem specifikus sáv.Az ATGC a legjobban véletlenszerűen oszlik el, elkerülve az 5-nél több purin- vagy pirimidinnukleotidból álló klasztereket.Multi-gc az 5′-véghez és a közbenső szekvenciákhoz a stabilitás növelése érdekében, kerülje a gazdag GC-t a 3′-végen, ne legyen GC az utolsó 3 bázisnál, vagy ne legyen GC az utolsó 5 bázisból 3-nál.
4. Kerülje el a primerek másodlagos szerkezetét, és kerülje a komplementációt két primer között, különösen a 3'-végen, különben primer dimer képződik, és nem specifikus amplifikált sávok keletkeznek.
5. A primerek 3' végén lévő bázisokat, különösen az utolsó és utolsó előtti bázist, szigorúan párosítani kell, hogy elkerüljük a nem párosított terminális bázisok miatti PCR-kudarcot.
6. A primerek megfelelő hasítási helyekkel rendelkeznek vagy adhatók hozzá, és az amplifikált célszekvenciának előnyösen megfelelő hasítási helyekkel kell rendelkeznie, ami nagyon előnyös hasítási analízis vagy molekuláris klónozás szempontjából.
7. A primerek specifitása: a primereknek nem lehet nyilvánvaló homológiájuk a nukleinsavszekvencia-adatbázis más szekvenciáival.
8. Tanulja meg a szoftver használatát: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Ez az online design működik a legjobban).
A fenti tartalom a primer tervezési problémák legalább 99%-át megoldja.
Irányítsd az alapozó tervezésének részleteit
1. Alapozó hossza
Az alapozó általános hossza 18-30 bázis.Általában a primer lágyítási hőmérsékletét meghatározó legfontosabb tényező a primer hossza.A primer lágyítási hőmérsékletét általában megválasztják (Tm érték -5 ℃), és néhány közvetlenül a Tm értéket használja.Az alábbi képletekkel nagyjából kiszámítható a primerek lágyítási hőmérséklete.
Ha a primer hossza kisebb, mint 20 bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5 ℃
Ha a primer hossza nagyobb, mint 20 bp: 62,3℃+0,41℃(%GC)-500/hossz-5℃
Ezen kívül sok szoftverrel az izzítási hőmérsékletet is ki lehet számítani, más lesz a számítási elve, így előfordulhat, hogy a számított értékben előfordulhat egy kis hézag.A PCR-reakciók optimalizálása érdekében a legrövidebb primereket alkalmazzák, amelyek legalább 54 ℃-os kapcsolódási hőmérsékletet biztosítanak a legjobb hatékonyság és specifitás érdekében.
Összességében a primer specificitása négyszeresére nő minden további nukleotid esetén, így a legtöbb alkalmazásnál a minimális primer hossza 18 nukleotid.A primer hosszának felső határa nem túl fontos, elsősorban a reakció hatékonyságával kapcsolatos.Az entrópia miatt minél hosszabb a primer, annál kisebb sebességgel kötődik a cél-DNS-hez, hogy stabil, kétszálú templátot hozzon létre a DNS-polimeráz kötéséhez.
Amikor szoftvert használunk a primerek tervezéséhez, a primerek hosszát a TM értékkel lehet meghatározni, különösen a fluoreszcencia kvantitatív PCR primereknél, a TM=60 ℃-t vagy hasonlót kell ellenőrizni.
2.GC tartalom
Általában a primer szekvenciák G+C tartalma 40-60%, és egy primerpár GC-tartalmát és Tm-értékét össze kell hangolni.Ha a primernek komoly GC vagy AT tendenciája van, megfelelő mennyiségű A, T vagy G és C farok adható a primer 5' végéhez.
3. Izzítási hőmérséklet
Az izzítási hőmérsékletnek 5 °C-kal alacsonyabbnak kell lennie, mint a láncbontási hőmérséklet.Ha a primer bázisok száma kicsi, az annealing hőmérséklete megfelelően növelhető, ami növelheti a PCR specificitását.Ha a bázisok száma nagy, az izzítási hőmérséklet megfelelően csökkenthető.A 4 ℃ ~ 6 ℃ közötti párosítási hőmérséklet különbség nem befolyásolja a PCR hozamát, de ideális esetben a primerpár párosítási hőmérséklete azonos, ami 55 ℃ és 75 ℃ között változhat.
4. Kerülje az amplifikációs sablon másodlagos szerkezeti területét
Az amplifikált fragmens kiválasztásakor a legjobb elkerülni a templát másodlagos szerkezeti régióját.A célfragmentum stabil másodlagos szerkezete megfelelő számítógépes szoftverrel előre jelezhető és megbecsülhető, ami segít a sablon kiválasztásában.A kísérleti eredmények azt mutatják, hogy a tágulás gyakran sikertelen, ha a kitágítandó tartomány szabad energiája (△G) kisebb, mint 58,6 lkJ/mol.
5. Nem egyezik a cél DNS-sel
Ha az amplifikált cél-DNS-szekvencia nagy, a primer a cél-DNS több részéhez kötődhet, ami több sávot eredményezhet az eredményben.Ezúttal a BLAST szoftvertesztelés, weboldal használata szükséges:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Válassza a Két sorozat egymáshoz igazítása (bl2seq) lehetőséget.
A primer szekvenciák beillesztése az 1. zónába és a cél DNS szekvenciák a 2. zónába felcserélhető, és a BLAST kiszámítja a komplementer, antiszensz és egyéb lehetőségeket, így a felhasználóknak nem kell észrevenniük, hogy mindkét lánc szenzorlánc-e.A GI-számot is megadhatja, ha ismeri a sorozat GI-számát az adatbázisban, így nem kell nagy részt beillesztenie a sorozatból.Végül kattintson az Align at 3 (Igazítás a 3-ra) gombra, hogy megnézze, van-e a primernek több homológ helye a cél DNS-ben.
6. Alapozó terminál
A primer 3 '-es vége az a hely, ahol a kiterjesztés kezdődik, ezért fontos, hogy elkerüljük az eltéréseket.A 3'-vég nem lehet több, mint 3 egymást követő G vagy C, mert ez azt eredményezi, hogy a primer tévedésből aktiválódik a G+C dúsító szekvencia régióban.A 3'-vég nem képezhet másodlagos struktúrát, kivéve a speciális PCR (AS-PCR) reakciókban, a primer 3'-vége nem illeszthető össze.Például, ha a kódoló régiót amplifikálják, a primer 3'-végét nem szabad a kodon harmadik pozíciójában befejezni, mert a kodon harmadik pozíciója hajlamos a degenerációra, ami befolyásolja az amplifikáció specificitását és hatékonyságát.Az annexiós primerek használatakor vegye figyelembe a kodonhasználati táblázatot, ügyeljen a biológiai preferenciára, ne használjon annexációs primereket a 3′ végén, és használjon magasabb koncentrációjú primereket (1 uM-3 uM).
7. Primerek másodlagos szerkezete
Maguk a primerek nem tartalmazhatnak komplementer szekvenciákat, különben maguk a primerek hajtűs szerkezetekké hajtogatnak, és ez a másodlagos szerkezet a sztérikus akadályok miatt befolyásolja a primerek és templátok kötődését.Ha mesterséges megítélést alkalmazunk, maguk a primerek folytonos komplementer bázisai nem lehetnek nagyobbak 3 bp-nál.A két primer között nem lehet komplementaritás, különösen a 3'-vég komplementer átfedését kell kerülni, hogy megakadályozzuk a primer dimerek képződését.Általában nem lehet több, mint 4 egymást követő bázishomológia vagy komplementaritás egy primerpár között.
8. Adjon hozzá jelzőket vagy lókuszokat
Az 5'-végnek csekély hatása van az amplifikációs specifitásra, ezért módosítható anélkül, hogy az amplifikációs specifitást befolyásolná.A primer 5' végének módosítása a következőket tartalmazza: enzim restrikciós hely hozzáadása;Jelzett biotin, fluoreszcencia, digoxin, Eu3+, stb. Fehérjekötő DNS szekvenciák bevezetése;Mutációs helyek bevezetése, mutációs szekvenciák beiktatása és hiánya, promóter szekvenciák bevezetése stb. A többletbázisok többé-kevésbé befolyásolják az amplifikáció hatékonyságát és növelik a primer dimer képződésének esélyét, de bizonyos engedményeket kell tenni a következő lépésnél.A célszekvencián nem létező további szekvenciák, például restrikciós helyek és promoterszekvenciák hozzáadhatók a primer 5'-végéhez anélkül, hogy a specifitást befolyásolnák.Ezeket a szekvenciákat nem veszik figyelembe a primer Tm értékeinek kiszámításakor, de tesztelni kell a komplementaritás és a belső másodlagos szerkezet szempontjából.
9. Alklónok
A PCR legtöbbször csak előzetes klónozás, majd különböző vektorokba kell szubklónozni a célfragmenst, így a PCR lépésben további bázisokat kell terveznünk a következő művelethez.
Néhány szubklónozásra tervezett szekvenciát az alábbiakban foglalunk össze.
Restrikciós endonukleáz restrikciós helyet adtunk hozzá
Az enzim restrikciós helyek hozzáadása a leggyakrabban használt módszer a PCR-termékek szubklónozására.Általában a hasítási hely hat bázis, a hasítási hely 5'-vége mellett 2-3 védőbázist kell hozzáadni.A különböző enzimek által igényelt védőbázisok száma azonban eltérő.Például a SalⅠ nem igényel védőbázist, az EcoRⅤ 1 védőbázist, a NotⅠ 2 védőbázist, a HindⅢ pedig 3 védőbázist igényel.
LIC hozzáteszi a farkát
A LIC teljes neve Ligation-Independent klónozás, egy klónozási módszer, amelyet a Navogen talált ki kifejezetten a pET-vektor egy részére.A LIC módszerrel előállított pET hordozó nem komplementer, 12-15 bázisból álló egyszálú ragadós végekkel rendelkezik, amelyek kiegészítik a megfelelő ragadós végeket a célinszert fragmensen.Amplifikáció céljából az inszertált fragmens primer 5'-szekvenciájának ki kell egészítenie a LIC-vektort.A T4 DNS polimeráz 3′→5′ extranekt aktivitása rövid idő elteltével egyszálú ragadós véget képezhet a beillesztett fragmenten.Mivel a termék csak az elkészített inszert fragmentum és a vektor kölcsönös összekapcsolásával állítható elő, ez a módszer nagyon gyors és hatékony, és irányított klónozás.
Irányított TA klón add tail
A TA klónozás nem tudta a fragmentumot vektorba célozni, ezért később az Invitrogen bevezetett egy olyan vektort, amely a klónozást célozta meg, és amely az egyik végén négy kiemelkedő bázis GTGGS-t tartalmazott.Ezért a PCR primerek tervezésénél a komplementer szekvenciákat ennek megfelelően kell hozzáadni, hogy a fragmensek „orientálhatók legyenek”.
Ha időhiányban szenved, megpróbálhatja a közvetlen szintézist, a gént a vektorral kombinálva, amit a muzecularistáknál ET génszintézisnek hívunk.
D. In-Fusion klónozási módszer
Nincs szükség ligázra, nincs szükség hosszú reakcióra.Mindaddig, amíg a linearizált vektor mindkét végén egy szekvenciát viszünk be A primerek tervezésénél, majd a PCR-terméket és a linearizált vektort a BSA-t tartalmazó infúziós enzimoldatba adjuk és fél órára szobahőmérsékleten helyezzük el, a transzformáció elvégezhető.Ez a módszer különösen alkalmas nagy térfogatú konverzióra.
10. Egyesítse össze az alapozót
Néha csak korlátozott szekvenciainformáció ismeretes a primer tervezéséről.Például, ha csak az aminosav-szekvencia ismert, az összeolvadó primer megtervezhető.A fúziós primer különböző szekvenciák keveréke, amelyek reprezentálják az egyetlen aminosavat kódoló különböző bázislehetőségeket.A specifitás növelése érdekében hivatkozhat a kodonhasználati táblázatra, hogy csökkentse az annektációt a különböző organizmusok alaphasználati preferenciái szerint.A hipoxantin az összes bázissal párosítható, hogy csökkentse a primer lágyítási hőmérsékletét.Ne használja a csatolt bázisokat a primer 3′ végén, mert a 3′ végén lévő utolsó 3 bázis összekapcsolása elegendő ahhoz, hogy a PCR-t rossz helyen indítsuk el.Magasabb primer-koncentrációkat (1-3 μM) használnak, mivel sok annexiós keverékben a primerek nem specifikusak a céltemplátra.
PCR alapanyagokellenőrzés
1. Alapozó mennyisége
Az egyes primerek koncentrációja 0,1-1 umol vagy 10-100 pmol.Jobb a kívánt eredményt a legalacsonyabb mennyiségű alapozóval előállítani.A primer nagy koncentrációja eltérést és nem specifikus amplifikációt okoz, és növeli a dimerek kialakulásának esélyét a primerek között.
2. Primer koncentráció
A primerek koncentrációja befolyásolja a specificitást.Az optimális primer koncentráció általában 0,1 és 0,5 μM között van.A magasabb primer koncentrációk a nem specifikus termékek amplifikációjához vezetnek.
3. Az alapozó izzítási hőmérséklete
A primerek másik fontos paramétere az olvadási hőmérséklet (Tm).Ez az a hőmérséklet, amikor a primerek és a komplementer szekvenciák 50%-a kettős szálú DNS-molekulaként jelenik meg.A Tm érték szükséges a PCR lágyítási hőmérséklet beállításához.Ideális esetben az összekapcsolási hőmérséklet elég alacsony ahhoz, hogy biztosítsa a primerek hatékony összekapcsolódását a célszekvenciával, de elég magas ahhoz, hogy csökkentse a nem specifikus kötődést.Ésszerű lágyítási hőmérséklet 55 ℃ és 70 ℃ között.Az izzítási hőmérséklet általában 5 °C-kal alacsonyabb, mint az alapozó Tm-je.
Számos képlet létezik a Tm beállítására, amelyek nagymértékben változnak a használt képlettől és a primerek sorrendjétől függően.Mivel a legtöbb képlet becsült Tm-értéket ad, az összes lágyítási hőmérséklet csak kiindulási pont.A specifitás javítható több olyan reakció elemzésével, amelyek fokozatosan növelik a lágyítási hőmérsékletet.Kezdje a becsült Tm-5 ℃ alatt, és fokozatosan növelje az izzítási hőmérsékletet 2 ℃-os lépésekben.A magasabb hőkezelési hőmérséklet csökkenti a primer dimerek és a nem specifikus termékek képződését.A legjobb eredmény elérése érdekében a két primernek megközelítőleg Tm értékkel kell rendelkeznie.Ha a primerpárok Tm-különbsége nagyobb, mint 5 ℃, a primerek szignifikáns téves indítást mutatnak, ha a ciklusban alacsonyabb hőkezelési hőmérsékletet használnak.Ha a két primer Tm különbözik, állítsa a lágyítási hőmérsékletet 5 °C-kal alacsonyabbra, mint a legalacsonyabb Tm.Alternatív megoldásként a specificitás növelése érdekében először öt ciklust lehet végrehajtani magasabb Tm-re tervezett lágyítási hőmérsékleteken, majd a többi ciklust alacsonyabb Tm-re tervezett lágyítási hőmérsékleteken.Ez lehetővé teszi a célsablon részleges másolatának beszerzését szűkös körülmények között.
4. Az alapozó tisztasága és stabilitása
Az egyedi primerek standard tisztasága megfelelő a legtöbb PCR-alkalmazáshoz.A benzoil- és izobutil-csoportok sómentesítéssel történő eltávolítása minimális, ezért nem zavarja a PCR-t.Egyes alkalmazások tisztítást igényelnek a szintézis folyamatában lévő nem teljes hosszúságú szekvenciák eltávolításához.Ezek a csonkolt szekvenciák azért fordulnak elő, mert a DNS-szintézis-kémia hatékonysága nem 100%.Ez egy körkörös folyamat, amely ismétlődő kémiai reakciókat használ, amikor minden bázist hozzáadnak, hogy a DNS-t 3′-ról 5′-re alakítsák.Bármelyik ciklusban megbukhat.A hosszabb primerek, különösen azok, amelyek 50 bázisnál nagyobbak, nagy arányban tartalmaznak csonkolt szekvenciákat, és tisztítást igényelhetnek.
A primerek hozamát a szintetikus kémia és a tisztítási módszer hatékonysága befolyásolja.A biofarmakon cégek, mint például a Cytology és a Shengong, mindegyik minimális OD egységet használ az oligonukleozid teljes kibocsátásának biztosítására.Az egyedi alapozókat száraz por formájában szállítjuk.A legjobb, ha a primereket újra feloldjuk TE-ben, hogy a végső koncentráció 100 μM legyen.A TE jobb, mint az ionmentesített víz, mert a víz pH-ja gyakran savas, és az oligonukleozidok hidrolízisét okozza.
Az alapozók stabilitása a tárolási körülményektől függ.A száraz port és az oldott alapozókat -20 ℃-on kell tárolni.A TE-ben 10 μM-nál nagyobb koncentrációban oldott primerek -20 ℃-on stabilan tárolhatók 6 hónapig, de szobahőmérsékleten (15 ℃ és 30 ℃ között) csak 1 hétnél rövidebb ideig tárolhatók.A száraz por alapozók -20 C-on legalább 1 évig, szobahőmérsékleten (15 C és 30 C között) legfeljebb 2 hónapig tárolhatók.
5. Enzimek és koncentrációjuk
A jelenleg használt Taq DNS polimeráz alapvetően a coliform baktériumok által szintetizált génsebészeti enzim.A tipikus PCR-reakció katalizálásához szükséges enzimmennyiség körülbelül 2,5 U (100 ul teljes reakciótérfogatra utal).Ha a koncentráció túl magas, az nem specifikus amplifikációhoz vezethet;ha a koncentráció túl alacsony, a szintetikus termék mennyisége csökken.
6. A dNTP minősége és koncentrációja
A dNTP minősége szorosan összefügg a koncentrációval és a PCR amplifikáció hatékonyságával.A dNTP por szemcsés, változékonysága elveszti biológiai aktivitását, ha nem megfelelően tárolják.A dNTP oldat savas, ezért nagy koncentrációban kell használni, 1 M NaOH vagy 1 M Tris.HCL pufferoldattal, hogy a pH-t 7,0 ~ 7,5-re állítsuk be, kis mennyiségű alcsomagolás, fagyasztott tárolás -20 ℃-on.A többszöri fagyasztás-olvasztás lerontja a dNTP-t.A PCR-reakcióban a dNTP-nek 50-200 umol/l-nek kell lennie.Különös figyelmet kell fordítani arra, hogy a négy DNTPS koncentrációja egyenlő legyen (egyenlő mól készítmény).Ha bármelyikük koncentrációja eltér a többitől (magasabb vagy alacsonyabb), az eltérést okoz.A túl alacsony koncentráció csökkenti a PCR-termékek hozamát.A dNTP kombinálható Mg2+-szal és csökkentheti a szabad Mg2+ koncentrációját.
7. Templát (célgén) nukleinsav
A templát nukleinsav mennyisége és tisztítási foka a PCR sikerének vagy kudarcának egyik kulcsfontosságú láncszeme.A hagyományos DNS-tisztítási módszerek általában SDS-t és proteáz K-t használnak a minták emésztésére és ártalmatlanítására.Az SDS fő funkciói: lipidek és fehérjék feloldása a sejtmembránon, így a membránfehérjék feloldásával a sejtmembrán roncsolása, valamint a sejtmag fehérjék disszociációja a sejtben, az SDS fehérjékkel is kombinálható és kicsapódhat;A proteáz K képes hidrolizálni és megemészteni a fehérjéket, különösen a DNS-hez kötött hisztonokat, majd szerves oldószert, fenolt és kloroformot használ a fehérjék és más sejtkomponensek extrahálására, valamint etanolt vagy izopropil-alkoholt a nukleinsav kicsapására.Az extrahált nukleinsav templátként használható PCR-reakciókhoz.Az általános klinikai kimutatási minták esetében egy gyors és egyszerű módszer használható a sejtek feloldására, a kórokozók lizálására, a fehérjék emésztésére és a kromoszómákból szabad célgénekre történő eltávolítására, valamint közvetlenül használható PCR amplifikációra.Az RNS-templát extrakció általában guanidin-izotiocianát vagy proteáz K módszert alkalmaz, hogy megakadályozza, hogy az RNáz lebontsa az RNS-t.
8.Mg2+ koncentráció
A Mg2+ szignifikáns hatással van a PCR amplifikáció specificitására és hozamára.Az általános PCR-reakcióban, amikor a különböző dNTP-k koncentrációja 200 mmol/l, a megfelelő Mg2+ koncentráció 1,5-2,0 mmol/L.Túl magas Mg2+ koncentráció, csökken a reakcióspecifitás, nem specifikus amplifikáció lép fel, túl alacsony koncentráció csökkenti a Taq DNS polimeráz aktivitását, ami a reakciótermékek csökkenését eredményezi.
A magnéziumionok a PCR számos aspektusát befolyásolják, például a DNS-polimeráz aktivitást, amely befolyásolja a hozamot;Egy másik példa a primer annealing, amely befolyásolja a specificitást.A dNTP és a templát magnézium-ionhoz kötődik, csökkentve az enzimaktivitáshoz szükséges szabad magnézium-ion mennyiségét.Az optimális magnéziumion-koncentráció a különböző primerpárok és templátok esetében eltérő, de a tipikus PCR kiindulási koncentráció 200 μM dNTP-vel 1,5 mM (megjegyzés: A valós idejű kvantitatív PCR-hez használjon 3–5 mM magnézium-ion oldatot fluoreszcens szondával).A szabad magnéziumionok magasabb koncentrációja növeli a hozamot, de növeli a nem specifikus amplifikációt és csökkenti a hűséget.Az optimális koncentráció meghatározásához magnézium-ion titrálást végeztünk 0,5 mM-os lépésekben 1 mM-ről 3 mM-ra.A magnéziumion-optimalizálástól való függés csökkentése érdekében Platinum Taq DNS polimeráz használható.A platina Taq DNS polimeráz a magnéziumion koncentrációk szélesebb tartományában képes fenntartani működését, mint a Taq DNS polimeráz, ezért kevesebb optimalizálást igényel.
9. Pcr-t elősegítő adalékok
A lágyítási hőmérséklet, a primer tervezés és a magnézium-ion koncentráció optimalizálása elegendő a legtöbb templát rendkívül specifikus amplifikációjához;néhány sablon azonban, beleértve a magas GC-tartalmúakat is, további intézkedéseket igényel.A DNS olvadáspontját befolyásoló adalékok egy másik módja a termékspecifitás és a hozam javításának.A legjobb eredmény érdekében a sablon teljes denaturálása szükséges.
Ezenkívül a másodlagos szerkezet megakadályozza a primer kötődését és az enzim kiterjesztését.
A PCR-adalékok, beleértve a formamidot, a DMSO-t, a glicerint, a betaint és a PCRx Enhancer Solution-t, fokozzák az amplifikációt.Lehetséges mechanizmusuk az olvadási hőmérséklet csökkentése, ezzel segítve a primerek összekapcsolódását és elősegítve a DNS polimeráz kiterjesztését a másodlagos szerkezeti régión keresztül.A PCRx megoldásnak más előnyei is vannak.Minimális magnéziumion-optimalizálásra van szükség, ha Platinum Taq DNS polimerázzal és Platinum Pfx DNS polimerázzal használják.Így a Platinum technikát az adalékanyaggal kombinálva növelik a specificitást, miközben csökkentik a harmadik megközelítés, a magnéziumion optimalizálás függőségét.A legjobb eredmény érdekében az adalékanyagok koncentrációját optimalizálni kell, különösen a DMSO, a formamid és a glicerin koncentrációját, amelyek gátolják a Taq DNS polimerázt.
10. Forró indítás
A hot start PCR az egyik legfontosabb módszer a PCR-specifitás javítására a jó primer tervezés mellett.Bár a Taq DNS polimeráz optimális megnyúlási hőmérséklete 72 ℃, a polimeráz szobahőmérsékleten aktív marad.Így nem specifikus termékek keletkeznek, ha a tartási hőmérséklet alacsonyabb, mint a lágyítási hőmérséklet a PCR reakció előkészítése során és a termikus ciklus elején.Miután kialakultak, ezek a nem specifikus termékek hatékonyan felerősödnek.A hot-start PCR különösen hatékony, ha a primer tervezéshez használt helyeket a genetikai elemek elhelyezkedése korlátozza, mint például a helyspecifikus mutációk, az expressziós klónozás vagy a DNS-manipulációhoz használt genetikai elemek felépítése és manipulálása.
A Taq DNS polimeráz aktivitásának korlátozására általánosan elterjedt módszer a PCR reakcióoldat jégen történő elkészítése és előmelegített PCR készülékbe helyezése.Ez a módszer egyszerű és olcsó, de nem fejezi be az enzim aktivitását, ezért nem szünteti meg teljesen a nem specifikus termékek amplifikációját.
A termikus beindítás késlelteti a DNS-szintézist azáltal, hogy gátolja egy lényeges komponenst, amíg a PCR-készülék el nem éri a denaturációs hőmérsékletet.A legtöbb kézi termikus iniciációs módszer, beleértve a Taq DNS polimeráz késleltetett hozzáadását is, nehézkes, különösen nagy áteresztőképességű alkalmazásoknál.Más termikus alapozási módszerek viaszpajzsot használnak az alapvető komponensek, köztük a magnéziumionok vagy enzimek bevonására, vagy a reaktív komponensek, például sablonok és pufferek fizikai izolálására.A termikus ciklus során a különböző komponensek felszabadulnak és összekeverednek, ahogy a viasz megolvad.A kézi melegindítási módszerhez hasonlóan a viaszpajzsos módszer is nehézkes és hajlamos a szennyeződésre, és nem alkalmas nagy teljesítményű alkalmazásokhoz.
A platina DNS polimeráz kényelmes és hatékony az automatikus hot start PCR-hez.A Platinum Taq DNS polimeráz rekombináns Taq DNS polimerázból áll, kombinálva Taq DNS polimeráz elleni monoklonális antitesttel.Az antitesteket PCR-rel állítják elő, hogy gátolják az enzimaktivitást a hosszan tartó hőmérséklettartás során.Taq DNS polimeráz szabadult fel a reakcióba a denaturációs lépés 94 ℃-os szigetelése során, helyreállítva a teljes polimeráz aktivitást.A termikus iniciációhoz kémiailag módosított Taq DNS polimerázzal ellentétben a platina enzim nem igényel hosszan tartó szigetelést 94°C-on (10-15 perc) a polimeráz aktiválásához.A PlatinumTaq DNS polimerázzal a Taq DNS polimeráz aktivitás 90%-a helyreállt 2 perc után 94°C-on.
11. Nest-PCR
A beágyazott primereket használó egymást követő amplifikációs körök javíthatják a specificitást és az érzékenységet.Az első kör egy szabványos 15-20 ciklusos erősítés.A kezdeti amplifikációs termék egy kis részét 100-1000-szeresére hígítottuk, és a második amplifikációs körhöz adtuk 15-20 ciklusra.Alternatív módon a kezdeti amplifikált termék méretezhető géltisztítással.A második amplifikációs körben egy beágyazott primert használnak, amely képes kötődni az első primeren belüli célszekvenciához.A beágyazott PCR alkalmazása csökkenti a több célhely amplifikációjának lehetőségét, mivel kevés olyan célszekvencia van, amely komplementer mindkét primerkészlettel.Ugyanaz a ciklusszám (30-40) ugyanazokkal a primerekkel amplifikálta a nem specifikus helyeket.A beágyazott PCR növeli a korlátozott célszekvenciák (pl. ritka mrnas) érzékenységét és javítja a nehéz PCRS (pl. 5′ RACE) specificitását.
12. Csökkenő PCR
A csökkenő PCR javítja a specifitást azáltal, hogy a PCR első néhány ciklusában szoros összeillesztési körülményeket alkalmaz.A ciklus a becsült Tm-nél körülbelül 5 °C-kal magasabb lágyítási hőmérsékleten kezdődik, majd minden ciklust 1 °C-kal 2 °C-ra csökkentenek, amíg a lágyítási hőmérséklet Tm 5 °C alá nem kerül.Csak a legnagyobb homológiájú célsablon kerül felerősítésre.Ezek a termékek tovább bővülnek a következő ciklusokban, kiszorítva az erősített, nem specifikus termékeket.A leszálló PCR olyan eljárásokban hasznos, ahol a primer és a céltemplát közötti homológia mértéke nem ismert, mint például az AFLP DNS ujjlenyomat.
Kapcsolódó PCR készletek
A 2× PCR hősTMA Mix rendszer jobban tolerálja a PCR inhibitorokat, mint a hagyományos PCR Mix rendszer, és könnyen megbirkózik a különféle komplex templátok PCR amplifikációjával.Az egyedülálló reakciórendszer és a nagy hatékonyságú Taq Hero a PCR-reakciót magasabb amplifikációs hatékonyságot, specifitást és érzékenységet eredményez.
Magasabb erősítési hatásfok
5'→3' DNS polimeráz aktivitással és 5'→3' exonukleáz aktivitással rendelkezik, 3'→5' exonukleáz aktivitás nélkül.
Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
A specifikus – optimalizált puffer és a hot-start Taq enzim megakadályozhatja a nem specifikus amplifikációt és a primer dimer képződését
Nagy érzékenység – érzékeli a sablon alacsony példányszámát
A készlet egyedi Foregene reverz transzkripciós reagenst és Foregene HotStar Taq DNS polimerázt használ, egyedi reakciórendszerrel kombinálva, hogy hatékonyan javítsa az amplifikációs hatékonyságot és a reakció specifitását.
Feladás időpontja: 2023. május 09
