Az RT-qPCR kísérlet RNS extrakciót és minőségértékelést, reverz transzkripciót és qPCR három lépést foglal magában, mindegyik lépéshez sok óvintézkedés tartozik, az alábbiakban részletesen bemutatjuk.

Ⅰ.RNS minőségértékelés

Az RT-qPCR kísérletben az RNS extrakció befejezése után az RNS minőségét kell értékelni, és az utókísérletet csak minősítése után lehet elvégezni.Az értékelési módszerek közé tartozik a spektrofotométer, az Agilent gélelektroforézis, az Agilent 2100 analízis, amelyek közül a leggyakrabban használt spektrofotométer és agaróz gélelektroforézis módszer a detektálás.Meg kell jegyezni, hogy ezt a két módszert együtt kell alkalmazni az RNS-koncentráció, tisztaság és integritás kimutatásának és elemzésének befejezéséhez, az RNS minőségének biztosítása érdekében.

Kapcsolódó RNS izolációs készlet: 

Cell Total RNS Isolation Kit

Különböző tenyésztett sejtekből 11 perc alatt nagy tisztaságú és jó minőségű teljes RNS nyerhető.

Animal Total RNS Isolation Kit

Gyorsan és hatékonyan vonja ki a nagy tisztaságú és kiváló minőségű teljes RNS-t különböző állati szövetekből.

Spektrofotométer:

A spektrofotométer elsősorban az RNS koncentrációjának és tisztaságának meghatározására szolgál, de nem képes kimutatni az RNS és a genomiális maradék integritását.Közülük az A260/280 és az A260/230 fontos paraméterei az RNS-tisztaság kimutatásának, az RNS tisztasága pedig az értékek ingadozása szerint mutatható ki:

1. 1,9< A260/280< 2,1, ami azt jelzi, hogy az RNS tisztasága jó;A260/280<1,9, ami azt jelzi, hogy fehérjemaradék lehet az RNS-ben;A260/280>2.1, ami az RNS lehetséges részleges lebomlására utal, ami agaróz gélelektroforézissel tovább igazolható.

2. 2,0< A260/230< 2,2, ami azt jelzi, hogy az RNS tisztasága jó;A260/230< 2,0, ami azt jelzi, hogy az RNS-ben szerves reagensek maradványai lehetnek, például fenolok, etanol vagy cukrok.

Agaróz gél elektroforézis:

Az agaróz gél elektroforézis vizsgálata képes elemezni az RNS integritását, a genomot és a fehérjemaradékokat, de nem képes pontosan meghatározni az RNS koncentrációját vagy kimutatni a szerves reagensek maradékait.Vegyünk például eukarióta RNS-sablonokat:

1. Az RNS-t agaróz gélelektroforézisnek vetettük alá.Ha csak három 28sRNS, 18sRNS és 5,8sRNS sáv volt a géltérképen, az azt jelzi, hogy a kivont RNS sértetlen.Ha húzós jelenség van, az az RNS részleges lebomlását jelzi.

2. Ha egyetlen világos sáv van a ragasztólyuk és a 28sRNS sáv között, akkor genomi DNS-maradék lehet.

3. Ha csíkok jelennek meg a ragasztólyukban, az azt jelzi, hogy fehérje- és egyéb makromolekuláris anyagok maradványai lehetnek.

Ⅱ. Fordított átírás

Miután az RNS-kivonás befejeződött, azt cDNS-vé kell fordítani a további kísérletekhez, ezért a megfordítási lépés elengedhetetlen.A reverz transzkripciót a reverz transzkriptáz és a primer kiválasztásából vezetjük be:

Reverz transzkriptáz kiválasztása:

A tipikus reverz transzkriptázok közé tartozik az AMV RTase és az MMLV RTase.Az AMV RTase RNáz H-ja erős aktivitással, rövid szintézishosszúsággal, alacsony szintézismennyiséggel és jó termikus stabilitással rendelkezik (42 ~ 55 ℃).Az MMLV RTase RNáz H aktivitása gyenge, a szintézis hossza hosszú, a szintézis mennyisége magas, és a termikus stabilitás gyenge (37 ~ 42 ℃).

Mivel az RNáz H enzim az RNS templát lebontó funkcióját tölti be, a reverz transzkripció során a gyenge RNáz H aktivitású MMLV-t kell előnyben részesíteni, és a későbbi géntechnológiát követően az MMLV termikus stabilitása minőségi ugrást ért el.Foregenét szedniForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV a fordított transzkripcióhoz) Példaként ez egy új reverz transzkriptáz, amelyet genetikai rekombinációs technológiával módosított E. coli baktériumokban expresszálnak.Ez egy rekombináns DNS-polimeráz, amely komplementer DNS-szálat szintetizál egyszálú RNS-ből, DNS-ből vagy RNS:DNS hibridből.Nincs RNáz H aktivitása, erős stabilitása, erős RNS-affinitása és nagy detektálási érzékenysége.

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV a fordított transzkripcióhoz)

Alapozó kiválasztása:

Az RT primerek általában három kategóriába sorolhatók: oligo dT, random primerek és génspecifikus primerek.Válassza ki a megfelelő primereket a különböző kísérleti követelményeknek megfelelően.

1. Ha a templát eukarióta eredetű, és a késői cDNS-t használjuk a rutin PCR-amplifikációhoz, az Oligo (dT) használata javasolt;Ha a következő kísérletet csak qPCR-re használjuk, az Oligo (dT) véletlenszerű primerekkel való keverése javasolt a reverz transzkripció hatékonyságának javítása érdekében.

2. Ha a templát prokariótákból származik, akkor a reverz transzkripcióhoz véletlenszerű primereket vagy génspecifikus primereket kell kiválasztani.

Ⅲ.qPCR

A fluoreszcencia kvantitatív meghatározása elsősorban a kvantitatív módszerek, a primer tervezési elvek, a ROX kiválasztása, a reakciórendszer konfigurációja és a reakciókörülmények beállítása stb. alapján történik.

Kvantitatív módszerek kiválasztása:

A kvantitatív módszerek relatív kvantitatív és abszolút kvantitatív módszerekre oszthatók.A relatív kvantifikáció segítségével kimutatható egyes kezelési módszerek génexpresszióra gyakorolt ​​hatása, kimutatható a génexpresszió különböző időpontokban való eltérése és összehasonlítható a génexpresszió különbsége a különböző szövetekben.Az abszolút mennyiségi meghatározással kimutatható a vírusban lévő nukleinsav mennyisége és így tovább.Kísérletek végzésekor saját kísérleteinknek megfelelően kell kiválasztanunk a megfelelő kvantitatív módszereket.

Primer tervezési alapelvek:

A qPCR primer tervezése közvetlenül kapcsolódik az amplifikáció hatékonyságához és a termék specifitásához.Ezért a jó primerek helyes tervezése a sikeres qPCR első lépése.Az alapozó tervezésénél a következő alapelvekre kell ügyelni, ha megfelelünk a hagyományos alapozótervezés elvének:

1. A célfragmens hosszát 100 és 300 bp között szabályozzuk;

2. Kereszt-exon tervezés a genomiális DNS hatásának elkerülésére;

3. A tervezett primerek amplifikációs hatékonyságát tesztelni kell, és csak akkor használhatók kvantitatív kísérletekre, ha az amplifikációs hatékonyság eléri a standardot (90-110%);

4. A primer koncentrációja általában 0,1 uM és 1,0 uM között van optimalizálva.

Válogatás aROX:

A kvantitatív reakció során a ROX egyenletesen tudja beállítani a párolgás és kondenzáció okozta optikai útkülönbséget, pipettázási hibát vagy térfogatkülönbséget, javítva az eredmények megismételhetőségét.Meg kell azonban jegyezni, hogy a ROX kiválasztása a hangszerhez kapcsolódik.Ha a qPCR műszer rendelkezik a furatok közötti különbség automatikus korrekciójával, akkor nem kell ROX-ot hozzáadnia;ellenkező esetben ROX korrekciót kell hozzáadnia.A kis partnereknek a reagensek vásárlásában az alkalmazott műszernek megfelelően kell kiválasztaniuk a megfelelő ROX-ot, elkerülve a későbbi hibákat.

A reakciórendszer elkészítése:

Előnyös a 20 ul és 50 ul reakciótérfogat.A rendszer kialakításakor a következő szempontokra kell figyelni:

1. A reakciórendszert szellőztetéssel kell előkészíteni az ultra-tiszta munkaasztalon, új ddH₂O-t használunk minden kísérlethez;

2. Minden kísérletben fel kell készíteni az NTC-t annak ellenőrzésére, hogy van-e szennyezés a rendszerben, és minden egyes primerpárnak NTC-t kell végeznie a rendszer előkészítésekor;

3. Annak kimutatására, hogy van-e gDNS-maradék az RNS-templátban, minden egyes mintához NRT készíthető kimutatásra;

4. A rendszer elkészítésekor egy mintára legalább 3 technikai ismétlést javasolt elvégezni;

5. Ha a templát cDNS, ajánlatos 5-10-szeres hígítást végezni a reverz transzkripciós rendszer qPCR kísérletre gyakorolt ​​gátló hatásának csökkentése érdekében.A sablonmennyiséget célszerű gradienssel feltárni, hogy a CT-érték 20-30 közé essen;

6. Határozza meg a szükséges reakciószámot, növelje 5-10%-kal a reakciók száma alapján, és számítsa ki a térfogatkonfiguráció számát;

7, a rendszert a premix elve alapján készítik el, centrifugálás után keverik össze, és biztosítják, hogy ne legyenek buborékok;

8, Amennyire lehetséges, válasszon kiegészítő fogyóeszközöket.

Kapcsolódó RT-qPCR készlet