Pipetta hegyek és EP csövek sterilizálása stb.

1. Készítsen elő 0,1%-os (egy ezrelékes) DEPC-t (nagyon mérgező anyag) ionmentesített vízzel, óvatosan használja elszívóernyőben, és tárolja 4°C-on fénytől védve;

A DEPC víz DEPC-vel kezelt, magas hőmérsékleten és nagy nyomással sterilizált tiszta víz.RNáz-, DNáz- és proteinázmentesnek tesztelve.

2. Helyezze a pipettahegyet és az EP-csövet 0,1%-os DEPC-be, és ellenőrizze, hogy a pipettahegy és az EP-cső tele van-e 0,1%-os DEP-vel.

3. Fénytől védve hagyjuk állni egy éjszakán át (12-24 óra)

4. A hegyet és az EP csövet tartalmazó dobozt nem kell DEPC-be áztatni.Miután durván eltávolította a DEPC vizet a hegyből vagy az EP-csőből, csomagolja be és csomagolja be.

5. 121 Celsius-fok, 30 perc

6. 180 Celsius fok, szárítás több órán keresztül (legalább 3 óra)

Megjegyzés: a.Viseljen latex kesztyűt és maszkot a DEPC kezelésekor!b, vagy DEPC sterilizálás nélkül, 130 ℃, 90 perces autokláv (sok laboratóriumban kétszer magas hőmérsékletű sterilizálás)

RNS extrakciós szempontok

A szöveti RNS izolálás kudarcának két fő jelensége

RNS lebomlása és szennyeződések maradványai a szövetekben,a degradációt illetően először nézzük meg, hogy a tenyésztett sejtekből kivont RNS miért nem bomlik le könnyen.A meglévő RNS extrakciós reagensek mindegyike olyan komponenseket tartalmaz, amelyek gyorsan gátolják az RNázt.Adja hozzá a lizátumot a tenyésztett sejtekhez, és egyszerűen keverje össze, minden sejt alaposan összekeverhető a lizátummal, és a sejtek teljesen lizálódnak.A sejtek lizálása után a lizátumban lévő hatóanyagok azonnal gátolják az intracelluláris RNázt, így az RNS érintetlen marad.Ez azt jelenti, hogy mivel a tenyésztett sejtek könnyen és teljes mértékben érintkezésbe kerülnek a lizátummal, RNS-ük nem bomlik le könnyen;másrészt a szövetben lévő RNS könnyen lebomlik, mivel a szövet sejtjei nem könnyen érintkeznek gyorsan a lizátummal.elegendő érintkezés miatt.Így,Feltéve, hogy van mód a szövet egyetlen sejtté alakítására, miközben gátolja az RNS-aktivitást, a lebomlás problémája teljesen megoldható.

A folyékony nitrogén őrlés a leghatékonyabb ilyen módszer.A folyékony nitrogén őrlési módszer azonban nagyon problémás, különösen akkor, ha nagy a minták száma.Ebből született a következő legjobb dolog: a homogenizátor.AhomogenizátorA módszer nem foglalkozik azzal a kérdéssel, hogy miként gátolja az RNáz aktivitását, mielőtt a sejtek érintkezésbe kerülnének a lizátummal, hanem inkább azért imádkozik, hogy a szövetek felbomlásának sebessége gyorsabb legyen, mint az a sebesség, amellyel az intracelluláris RNáz lebontja az RN-t.

Az elektromos homogenizátor hatása jobb,és az üveghomogenizátor hatása gyenge, de általában a homogenizáló módszer nem tudja megakadályozni a degradációs jelenséget.Ezért, ha az extrakció romlik, az eredeti elektromos homogenizátort kell használni a folyékony nitrogénnel való őrléshez;az eredeti üveghomogenizátort elektromos homogenizátorra kell cserélni vagy közvetlenül folyékony nitrogénnel őrölni.A probléma majdnem 100%-ban megoldható.megoldódni.

A további kísérleteket érintő szennyezőmaradvány-problémának több oka van, mint a lebomlásnak, és ennek megfelelően a megoldások is eltérőek.Következtetésképpen,ha a szövetben lebomlás vagy visszamaradt szennyeződések vannak, az extrakciós módszert/reagenst az adott kísérleti anyaghoz optimalizálni kell.Nem kell az értékes mintáit az optimalizáláshoz felhasználnia: vásárolhat néhány apró állatot, például halat/csirkét a piacról, az anyag megfelelő részét RNS-kinyeréshez, a másik részét pedig fehérje kinyeréshez – őrölheti szájjal, gyomorral és belek Kivonattal.

A kivont RNS cél RNS-ét különböző követési kísérletekhez használjuk fel, minőségi követelményei eltérőek

A cDNS-könyvtár felépítéséhez az RNS integritása szükséges enzimreakció-inhibitorok maradékai nélkül;Northern magasabb RNS-integritást és alacsonyabb követelményeket igényel az enzimreakció-inhibitorok maradékaival szemben;Az RT-PCR nem igényel túl magas RNS integritást,de gátolja az enzimreakciókat.A maradékanyagra vonatkozó követelmények szigorúak.A bemenet határozza meg a kimenetet;minden alkalommal, amikor a cél a legmagasabb tisztaságú RNS beszerzése, az embereknek és pénzbe kerül.

Minták gyűjtése/tárolása

A lebomlást befolyásoló tényezők Miután a minta elhagyja az élő testet/vagy az eredeti növekedési környezetet, a mintában lévő endogén enzimek elkezdik lebontani az RNS-t,a lebomlási sebesség pedig az endogén enzimek tartalommal és a hőmérséklettel függ össze.Hagyományosan csak két módja van az endogén enzimaktivitás teljes gátlásának: azonnal adjunk hozzá lizátumot, majd alaposan és gyorsan homogenizáljuk;apró darabokra vágjuk és folyékony nitrogénben azonnal lefagyasztjuk.Mindkét megközelítés gyors működést igényel.Az utóbbi minden mintára alkalmas, míg az előbbi csak alacsony sejt- és endogén enzimtartalmú és könnyebben homogenizálható szövetekre alkalmas.Pontosabban, a növényi szöveteket, a májat, a csecsemőmirigyet, a hasnyálmirigyet, a lépet, az agyat, a zsírt, az izomszövetet stb. célszerű folyékony nitrogénnel lefagyasztani a folytatás előtt.

A minták feldarabolása és homogenizálása

A lebomlást és a hozamot befolyásoló tényezők A minta töredezettsége azaz alapos homogenizáláshoz, amely az RNS teljes és teljes felszabadulását szolgálja.A sejtek közvetlenül homogenizálhatók anélkül, hogy eltörnének.A szövetek csak feltörés után homogenizálhatók.Az élesztőt és a baktériumokat megfelelő enzimekkel fel kell törni, mielőtt homogenizálni lehetne őket.Az alacsonyabb endogén enzimtartalmú és könnyebben homogenizálható szövetek a lizátumban homogenizálóval egy időben összetörhetők és homogenizálhatók;növényi szövetből, májból, csecsemőmirigyből, hasnyálmirigyből, lépből, agyból, zsírból, izomszövetből és egyéb mintákból, amelyekben magas az endogén enzimek tartalma, vagy nem könnyen homogenizálhatók,így a szövetroncsolást és a homogenizálást külön kell elvégezni.A legmegbízhatóbb és legtermékenyebb darabolási módszer a folyékony nitrogénnel végzett őrlés, a homogenizálás legmegbízhatóbb módja az elektromos homogenizátor használata.Külön megjegyzés a folyékony nitrogénnel végzett őrléshez: a mintát nem szabad a teljes őrlési folyamat alatt kiolvasztani, mivel az endogén enzimek nagyobb valószínűséggel működnek fagyasztva.

Lizátum választása

A kezelés kényelmét és a visszamaradt endogén szennyeződések tényezőit befolyásolja Az általánosan használt lízisoldatok szinte gátolhatják az RNáz aktivitását.Ezért a lízisoldat kiválasztásának kulcsa a tisztítási módszerrel kombinálva.Egy kivétel van:a magas endogén enzimtartalmú mintáknál javasolt fenolt tartalmazó lizátum használata az endogén enzimek inaktiválási képességének növelése érdekében.

A tisztítási módszer megválasztása

A visszamaradt endogén szennyeződéseket befolyásoló tényezők, az extrakciós sebesség Tiszta minták, például sejtek esetében szinte minden rendelkezésre álló tisztítási módszerrel kielégítő eredmények érhetők el.De sok más minta esetében, különösen azoknál, amelyekben nagy mennyiségű szennyeződés található, például növények, máj, baktériumok stb., a megfelelő tisztítási módszer kiválasztása kulcsfontosságú.Az oszlopos centrifugális tisztítási módszer gyors extrakciós sebességgel rendelkezik, és hatékonyan képes eltávolítani az RNS későbbi enzimatikus reakcióját befolyásoló szennyeződéseket, de drága (a Foregene költséghatékony készleteket kínál, további részletekért kattintsonitt);gazdaságos és klasszikus tisztítási módszerekkel, például LiCl-es kicsapással is kielégítő eredményt lehet elérni, de a műveleti idő hosszú..

„Három tudományág és nyolc figyelem” az RNS-kivonáshoz

1. fegyelem:Vess véget az exogén enzimek szennyeződésének.

1. megjegyzés:Szigorúan viseljen maszkot és kesztyűt.

Jegyzet 2:A kísérletben részt vevő centrifugacsöveket, csúcsfejeket, pipettarudakat, elektroforézis tartályokat és kísérleti padokat alaposan meg kell semmisíteni.

3. megjegyzés:A kísérletben részt vevő reagenseknek/oldatoknak, különösen a víznek, RNáz-mentesnek kell lennie.

2. fegyelem:Blokkolja az endogén enzimek aktivitását

4. megjegyzés:Válasszon megfelelő homogenizálási módszert.

5. megjegyzés:Válasszon megfelelő lizátumot.

6. megjegyzés:Szabályozza a minta kiindulási mennyiségét.

3. fegyelem:Tisztázza a kitermelés célját

7. megjegyzés:Ha bármely lizátumrendszer megközelíti a minta maximális kezdőmennyiségét, az extrakció sikerének aránya meredeken csökken.

8. megjegyzés:A sikeres RNS-kivonás egyetlen gazdasági kritériuma a későbbi kísérletek sikere, nem a hozam.

Az RNáz szennyeződés 10 legjobb forrása

1. Az ujjak az exogén enzimek első forrásai, ezért kesztyűt kell viselni és gyakran cserélni kell.Emellett maszkot is kell viselni, mert a légzés is fontos enzimforrás.A kesztyűs maszk viselésének további előnye a kísérletező védelme.

2. Pipettahegyek, centrifugacsövek, pipetták – Az RNáz nem inaktiválható önmagában sterilizálással, ezért a pipettahegyeket és centrifugacsöveket DEPC-vel kell kezelni, még akkor is, ha DEPC-kezeltként vannak megjelölve.A legjobb, ha speciális pipettát használunk, használat előtt 75%-os alkoholos vattakoronggal töröljük át, különösen a rudat;ezen kívül ügyeljen arra, hogy ne használjon fejeltávolítót.

3. A víznek/puffernek RNáz-szennyeződéstől mentesnek kell lennie.

4. Legalább a tesztasztalt le kell törölni 75%-os alkoholos vattakoronggal.

5.Endogén RNáz Minden szövet tartalmaz endogén enzimeket, így a szövetek folyékony nitrogénnel történő gyors fagyasztása a legjobb módja a degradáció csökkentésének.A folyékony nitrogén tárolási/őrlési módszere valóban kényelmetlen, de ez az egyetlen módja a magas endogén enzimszintű szöveteknek.

6. RNS minták Az RNS extrakciós termékek nyomokban RNáz szennyeződést tartalmazhatnak.

7. Plazmid extrakció A plazmid extrakció során gyakran Rnázt használnak az RNS lebontására, és a maradék Rnázt Proteináz K-vel kell emészteni és PCI-vel extrahálni.

8. RNS tárolása Még ha alacsony hőmérsékleten tároljuk is, nyomnyi mennyiségű RNáz RNS lebomlását okozza.Az RNS hosszú távú megőrzésére a legjobb megoldás a só/alkohol szuszpenzió, mivel az alkohol alacsony hőmérsékleten gátolja az összes enzimaktivitást.

9. Ha a kationok (Ca, Mg) tartalmazzák ezeket az ionokat, 80 C-on 5 percig tartó melegítés hatására az RNS felhasad, így ha az RNS-t melegíteni kell, akkor a tartósító oldatnak kelátképző szert kell tartalmaznia (1 mM nátrium-citrát, pH 6,4).

10. A következő kísérletekben használt enzimek RNázzal szennyezettek lehetnek.

10 tipp az RNS-kivonáshoz

1: Gyorsan akadályozza meg az RNáz aktivitását.A mintákat a gyűjtés után gyorsan lefagyasztják, és az RNáz inaktiválódik a lízis során végzett gyors működéssel.

2: Válassza ki a megfelelő extrakciós módszert a magas ribozim tartalmú szövetek számára, és zsírszövetben a legjobb a fenolt tartalmazó módszer alkalmazása.

3: Az előrejelzés minőségéhez Northern, a cDNS-könyvtár felépítéséhez nagy integritás szükséges, az RT-PCR és az RPA (Ribonuclease protection assay) pedig nem igényel magas integritást.Az RT-PCR nagy tisztaságot igényel (enzim inhibitor maradékok).

4: Az alapos homogenizálás a kulcsa a hozam javításának és a lebomlás csökkentésének.

5: Ellenőrizze az RNS elektroforézis kimutatásának integritását, 28S: 18S = 2: 1 teljes jel, 1: 1 is elfogadható a legtöbb kísérletnél.

6: DNS eltávolítása RT-PCR-hez, array elemzéshez A DNS eltávolításához a legjobb a Dnáz I használata.

7: Csökkentse az exogén enzimek szennyeződését – az enzimeket nem lehet kívülről importálni.

8: Alacsony koncentrációjú nukleinsav koncentrálásakor koprecipitációs reagenst kell hozzáadni.De az enzimeket tartalmazó társprecipitáns és a DNS szennyeződés megelőzése érdekében.

9: Alaposan oldja fel az RNS-t, ha szükséges, melegítse 65 C-on 5 percig.

megfelelő tárolási mód

–20C-on rövid ideig, –80C-on sokáig tárolható.Az RNS-hozamok javításának első lépése annak felismerése, hogy a különböző minták RNS-tartalma nagyon eltérő.Nagy mennyiségben (2-4 ug/mg), például májban, hasnyálmirigyben, szívben, közepes mennyiségben (0,05-2 ug/mg), például agyban, embrióban, vesében, tüdőben, csecsemőmirigyben, petefészekben, alacsony mennyiségben (<0,05 ug/mg) mg), például hólyagban, csontokban, zsírokban.

1: Lizálja a sejteket az RN felszabadítása érdekében – ha az RNS nem szabadul fel, a hozam csökken.Az elektromos homogenizálás jobban működik, mint a többi homogenizálási módszer, de előfordulhat, hogy más módszerekkel is kombinálni kell, mint például a folyékony nitrogén pépesítése, az enzimatikus emésztés (lizozim/litikáz).

2: Az extrakciós módszer optimalizálása.A fenol alapú módszereknél a legnagyobb probléma a nem teljes rétegződés és a részleges RNS elvesztése (a felülúszót nem lehet teljesen eltávolítani).A hiányos rétegződés hátterében a magas nukleinsav- és fehérjetartalom áll, amely a felhasznált lizátum mennyiségének növelésével vagy a minta mennyiségének csökkentésével oldható meg.A zsírszövethez kloroformos extrakciót adtunk.Az RNS-veszteség csökkenthető visszapumpálással vagy a szerves réteg eltávolításával, majd centrifugálással.Az oszlopos centrifugáláson alapuló módszerekkel a legnagyobb probléma a felesleges minta.

Klasszikus extrakciós tippek

1. Fenol tisztítás: Adjunk hozzá azonos térfogatú 1:1 fenol/kloroform elegyet, és erőteljesen keverjük 1-2 percig.Centrifugálja nagy sebességgel 2 percig.Óvatosan távolítsa el a felülúszót (80-90%).Soha ne érjen a középső réteghez.A reakcióoldat azonos térfogatát hozzáadhatjuk a fenol/kloroform keverékhez, és a felülúszót eltávolítjuk.A két felülúszót összekeverhetjük a nukleinsav-kicsapás érdekében a hozam javítása érdekében.Ne legyen túl gyengéd keverés közben, és ne próbálja meg eltávolítani az összes felülúszót.

2. Mosás 70-80%-os etanollal: Mosás közben a nukleinsavat szuszpendálni kell, hogy a maradék só kimosódjon.Ugyanakkor az etanol leöntése után azonnal centrifugálja nagy sebességgel néhány másodpercig, majd pipettával távolítsa el a maradék etanolt.Szobahőmérsékleten 5-10 percig tartó állás után oldjuk fel.

11. Speciális szervezetek kivonása

1. Rostos szövet: A rostos szövetből, például a szívből/vázizomzatból történő RNS-kivonás kulcsa a szövet teljes szétroncsolása.Ezeknek a szöveteknek alacsony a sejtsűrűsége, ezért az RNS mennyisége a szövet tömegére vonatkoztatva alacsony, és a legjobb, ha a lehető legtöbb kiindulási mennyiséget használjuk.Ügyeljen arra, hogy fagyos körülmények között alaposan őrölje meg a szövetet.

2. Magas fehérje/zsírtartalmú szövetek: magas az agy/növényi zsírtartalom.PCI extrakció után a felülúszó fehér pelyheket tartalmaz.A felülúszót kloroformmal újra extrahálni kell.

3. Magas nukleinsav/ribozim tartalmú szövetek: a lép/csecsemőmirigy magas nukleinsav és ribozim tartalmú.A szövet fagyasztásos körülmények között történő őrlése, majd gyors homogenizálása hatékonyan inaktiválhatja a ribozimeket.Ha azonban a lizátum túl viszkózus (a magas nukleinsavtartalom miatt), a PCI extrakció nem lesz képes hatékonyan rétegezni;több lizátum hozzáadása megoldhatja ezt a problémát.A többszörös PCI extrakció több maradék DNS-t távolíthat el.Ha közvetlenül az alkohol hozzáadása után fehér csapadék képződik, az DNS-szennyeződést jelez.A feloldás után savas PCI-vel történő újraextrakció eltávolíthatja a DNS-szennyeződést.

4. Növényi szövet: A növényi szövet összetettebb, mint az állati szövet.Általában a növényeket folyékony nitrogén körülmények között őrlik, így az RNS endogén enzimek általi lebontása nem gyakori.Ha a lebomlási probléma nem oldódik meg, azt szinte bizonyosan a mintában lévő szennyeződések okozzák.A sok növényben található szennyeződések maradványokhoz vezetnek, és a maradványok oka gyakran az, hogy ezeknek a szennyeződéseknek van némi hasonlósága az RNS-sel: Ön kicsap, én pedig kicsapok, te pedig adszorbeálok, én pedig adszorbeálok.Ezek a jellemzők határozzák meg, hogy nagyon erős enzimgátlók.

Jelenleg a kereskedelemben kapható RNS extrakciós reagensek kis módosításokkal szinte minden állati szövethez adaptálhatók, de kevés olyan kereskedelemben kapható RNS extrakciós reagens létezik, amely alkalmas lehet a legtöbb növényi szövetre.Szerencsére a Foregene különlegeset tud nyújtaninövényi RNS extrakciós készletek, nekünk vanPlant Total RNS izolációs készlet, Plant Total RNA Isolation Kit Plus.Ez utóbbi kifejezetten magas poliszacharid- és polifenoltartalmú növények számára készült.Az RNS-kivonásnál különösen jók a laborhasználók visszajelzései.

12. A minta fagyasztásának és felolvasztásának hatása A fagyasztott minta nagyobb is lehet, és RNS extrakció előtt le kell vágni.A minták hajlamosak megolvadni (esetleg részben) a vágás során.A fagyasztott mintákat le kell mérni az RNS extrakció előtt, és a folyamat során minden bizonnyal felengedés következik be.Néha a minta felolvadása a folyékony nitrogén őrlési folyamat során is előfordul;vagy a fagyasztott mintát közvetlenül adjuk a lizátumhoz folyékony nitrogén őrlés nélkül, és a teljes homogenizálás előtt biztosan megtörténik a felengedés.Kísérletek kimutatták, hogy a fagyasztott szövet hajlamosabb az RNS lebomlására a felengedés során, mint a friss szövet.A valószínű ok: A fagyasztás-olvadás folyamat felborítja a sejten belüli struktúrákat, megkönnyítve az endogén enzimek közvetlen érintkezését az RNS-sel.

13. Az RNS minőségének megítélése Általában az RNS integritásának megítélésére elektroforézist, az RNS tisztaságának megítélésére A260/A280-at használnak.Elméletileg az ép RNS aránya 28S:18S = 2,7:1, és a legtöbb adat a 28S:18S = 2:1 arányt hangsúlyozza.A helyzet az, hogy a sejteken kívüli mintákból szinte egyik RNS sem 2:1 arányú (ezt az Agilent Bioanalyzer segítségével kaptuk).

Az RNS elektroforézisének eredményeit számos tényező befolyásolja, beleértve a másodlagos szerkezetet, az elektroforézis körülményeit, a mintaterhelést, az EB általi telítés mértékét stb. Használjon natív elektroforézist az RNS kimutatására, és használja a DNS-markert kontrollként.Ha a 28S 2 kb és a 18S 0,9 kb tiszta, és a 28S: 18S > 1, az integritás megfelel a legtöbb későbbi kísérlet követelményeinek.

Az A260/A280 egy olyan mutató, amely sok zavart okozott.Mindenekelőtt tisztázni kell ennek a mutatónak az eredeti jelentését a nukleinsavak esetében: tiszta RNS, ennek A260/280 = kb. 2,0.A tiszta RNS az „ok”, és az A260/A280 = 2 a „hatás”.Most mindenki az A260/A280-at használja „okként”, és azt gondolja, hogy „ha A260/A280 = 2, akkor az RNS tiszta”, ami természetesen zavarhoz vezet.

Ha érdekli, hozzáadhat egy kevés extrakcióhoz gyakran használt reagenst, például fenolt, guanidin-izotiocianátot, PEG-et stb., az RNS-mintához, majd megmérheti az A260/A280 arányt.A valóság az, hogy az RNS extrakcióhoz használt reagensek közül sok, valamint a mintában lévő sok szennyeződés körülbelül A260 és A280 abszorbeál, ami hatással van az A260/A280-ra.

Jelenleg a legtanulságosabb megközelítés az RNS-minták szkennelése a 200-300 nm-es tartományban.A tiszta RNS görbéje a következő jellemzőkkel rendelkezik: a görbe sima, az A230 és az A260 két inflexiós pont, az A300 közel 0, az A260/A280 = 2,0 és az A260/A230 = körülbelül 2,0.Ha nem állnak rendelkezésre szkennelési adatok, akkor az A260/A230 arányt is meg kell határozni, mivel ez az arány érzékenyebb az összes, az enzimreakciót befolyásoló szennyeződésre.Vegye figyelembe az eszköz lineáris tartományát (0,1–0,5 A260 esetén).

Van még két hasznos jelenség: az arány körülbelül 0,3-mal alacsonyabb lesz, ha az A260/A280-at vízben mérik;míg a 10 mM EDTA-ban mért arány körülbelül 0,2-vel magasabb, mint az 1 mM EDTA-ban mért.

Kapcsolódó termékek:

Kínai Plant Total RNA Isolation Kit gyártó és szállító |Foregene (foreivd.com)

RNS izolációs sorozat Szállítók és gyárak |Kínai RNS izolációs sorozat gyártói (foreivd.com)

RNS-izolációs sorozat – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)