Köztudott, hogy a központi dogmában az RNS a transzkripciós közvetítő a DNS és a fehérje expressziója között.A DNS kimutatásával összehasonlítva az RNS kimutatása objektívebben tükrözi a génexpressziót az organizmusokban.Az RNS-t érintő kísérletek a következők: qRT-PCR, RNS-Seq és fúziós gén kimutatása stb. Magának az RNS-nek a jellemzői alapján (az RNS cukorgyűrűjében eggyel több szabad hidroxilcsoport van, mint a DNS cukorgyűrűjében), a környezetben található nagyszámú RNázzal párosulva az RNS instabilabb és könnyebben lebontható, mint a DNS.Szemet be, szemét ki, ha az RNS minősége nem jó, akkor a kísérleti eredményeknek nem kielégítőnek kell lenniük, kifejezetten pontatlan adatokként vagy rossz megismételhetőségként nyilvánulnak meg.Ezért nagyobb figyelmet kell fordítani az RNS feldolgozására, és a minőség-ellenőrzés összekapcsolása is fontosabb a későbbi kísérleti adatok pontosságának és pontosságának biztosítása érdekében.

Az RNS minőségellenőrzésére általában a következő általánosan használt módszereket alkalmazzák:

• Spektrofotometria
• agaróz gél elektroforézis
• Agilent Bioanalyzer
• valós idejű fluoreszcens kvantitatív PCR
• Qubit fluoreszcens festék módszer

01 Spektrofotometria

Az RNS konjugált kettős kötésekkel rendelkezik, és abszorpciós csúcsa 260 nm hullámhosszon van.Lambert-Beer törvénye szerint az RNS koncentrációt a 260 nm-es abszorpciós csúcsból számíthatjuk ki.Ezen kívül a 260nm, 280nm és 230nm-es abszorpciós csúcsok aránya alapján is kiszámíthatjuk az RNS tisztaságát.A 280 nm és a 230 nm a fehérjék, illetve a kis molekulák abszorpciós csúcsai.A minősített RNS-tisztaság A260/A280 és A260/A230 arányának 2-nél nagyobbnak kell lennie. Ha 2-nél kisebb, az azt jelenti, hogy fehérje vagy kis molekulájú szennyeződés van az RNS-mintában, és újra meg kell tisztítani.A szennyező források befolyásolják a későbbi kísérleteket, például gátolják a PCR-reakciók amplifikációs hatékonyságát, ami pontatlan kvantitatív eredményeket eredményez.Az RNS tisztasága nagyban befolyásolja a későbbi eredményeket, így a spektrofotometria általában nélkülözhetetlen minőségellenőrzési láncszem a nukleinsavkísérletek első lépésében.

1. ábra: Tipikus RNS/DNS abszorpciós spektrum

02 Agaróz gél elektroforézis

A tisztaság mellett az RNS integritása is az egyik fontos mutató az RNS minőségének megítélésében.Az RNS lebomlása nagyszámú rövid fragmentumhoz vezet a mintában, így csökken a hatékonyan kimutatható és a referenciaszekvenciával lefedhető RNS-fragmensek száma.Az RNS integritása ellenőrizhető a teljes RNS elektroforézisével 1%-os agaróz gélen.Ezzel a módszerrel saját maga konfigurálhatja a gélt, vagy használhatja az előre gyártott E-Gel™ rendszert az integritás tesztelésére.A teljes RNS több mint 80%-a riboszómális RNS, amelynek többsége 28S és 18S rRNS-ből áll (emlősrendszerekben).A jó minőségű RNS két nyilvánvaló fényes sávot mutat, amelyek 28S és 18S fényes sávok, 5 Kb és 2 Kb mellett, és az arány általában közel 2:1.Ha diffúz állapotban van, az azt jelenti, hogy az RNS-minta lebomolhatott, ezért az RNS minőségének további vizsgálatához javasolt a későbbiekben ismertetett módszer alkalmazása.

2. ábra: A degradált (2. sáv) és az ép RNS (3. sáv) összehasonlítása agaróz gélelektroforézissel

03 Agilent Bioanalyzer

A fent ismertetett agaróz gél elektroforézis módszer mellett, amely segítségével egyszerűen és gyorsan azonosíthatjuk az RNS integritását, az Agilent bioanalizátort is használhatjuk az RNS integritásának meghatározására.Mikrofluidika, kapilláris elektroforézis és fluoreszcencia kombinációját használja az RNS koncentrációjának és integritásának értékelésére.Az RNS-minta profiljának elemzésére szolgáló beépített algoritmus segítségével az Agilent bioanalizátor ki tudja számítani az RNS-integritás referenciaértékét, az RNA Integrity Number-t (a továbbiakban: RIN) [1].Minél nagyobb a RIN értéke, annál nagyobb az RNS integritása (1 rendkívül leromlott, 10 a legteljesebb).Egyes RNS-sel végzett kísérletek azt javasolják, hogy a RIN-t használják a minőségértékelés paramétereként.A nagy áteresztőképességű szekvenálási kísérleteket (továbbiakban NGS) példának véve az Oncomine™ Human Immune Repertoár irányelvei, amelyek a B-sejt- és T-sejt-antigén-receptorok kimutatására szolgálnak a Thermo Fisher's Oncomine panelsorozatban, azt sugallják, hogy a 4-nél nagyobb RIN-értékű minták, Hatékonyabb leolvasások és klónok mérhetők3 (Figure).A különböző panelekhez eltérő ajánlott tartományok vannak, és gyakran a magasabb RIN-érték hatékonyabb adatokat hozhat.

A 3. ábra az Oncomine™ Humán Immunrepertórium-kísérletekben a 4-nél nagyobb RIN-értékű minták hatékonyabb leolvasásokat és T-sejt-klónokat képesek kimutatni.【2】

A RIN értéknek azonban vannak bizonyos korlátai is.Bár a RIN magas korrelációt mutat az NGS kísérleti adatok minőségével, nem alkalmas FFPE mintákra.Az FFPE mintákat hosszú ideig kémiailag kezelték, és az extrahált RNS általában viszonylag alacsony RIN-értékkel rendelkezik.Ez azonban nem jelenti azt, hogy a kísérlet eredményes adatainak nem kell kielégítőnek lenniük.Az FFPE-minták minőségének pontos értékeléséhez a RIN-től eltérő méréseket kell használnunk.Az Agilent bioanalyzer a RIN mellett a DV200 értéket is képes kiszámítani az RNS minőség értékelési paramétereként.A DV200 egy olyan paraméter, amely kiszámítja a 200 bp-nál nagyobb fragmensek arányát egy RNS-mintában.A DV200 jobban jelzi az FFPE minta minőségét, mint a RIN.Az FFPE-vel extrahált RNS esetében nagyon magas korrelációt mutat a hatékonyan kimutatható gének számával és a gének sokféleségével [3].Bár a DV200 pótolni tudja az FFPE minőségi kimutatásának hiányosságait, az Agilent bioanalizátor továbbra sem tudja átfogóan elemezni az RNS-minták minőségi problémáit, beleértve azt is, hogy vannak-e inhibitorok a mintákban.Maguk az inhibitorok befolyásolhatják a downstream kísérletek amplifikációs hatékonyságát, és csökkenthetik a hasznos adatok mennyiségét.Annak megállapítására, hogy van-e inhibitor a mintában, alkalmazhatjuk a következőkben ismertetett valós idejű fluoreszcens kvantitatív PCR módszert.

04 valós idejű fluoreszcens kvantitatív PCR

A valós idejű fluoreszcens kvantitatív PCR módszer nemcsak a mintában lévő inhibitorokat képes kimutatni, hanem pontosan tükrözi az FFPE mintában lévő RNS minőségét is.Az Agilent biológiai analizátorokhoz képest a valós idejű fluoreszcens kvantitatív műszerek szélesebb körű alkalmazásuk miatt népszerűbbek a nagyobb biológiai laboratóriumokban.Az RNS-minták minőségének teszteléséhez csak belső referenciagénekhez, például GUSB-hoz (katalógusszám: Hs00939627) kell primer próbákat vásárolnunk vagy elkészítenünk.A primerek, próbák és standardok (ismert koncentrációjú teljes RNS) használatával abszolút kvantitatív kísérletek elvégzésére az effektív RNS-fragmens koncentráció az RNS-minőség értékelési standardjaként (röviden: Functional RNA Quantitation (FRQ)) számítható.Egy NGS-tesztben azt találtuk, hogy az RNS-minták FRQ-ja nagyon magas korrelációt mutat az effektív adatmennyiséggel.Minden 0,2 ng/uL FRQ-nál nagyobb minta esetén a leolvasások legalább 70%-a hatékonyan lefedi a referenciaszekvenciát (4. ábra).

A 4. ábra, a fluoreszcencia kvantitatív módszerrel kimutatott FRQ érték nagyon magas korrelációt mutat (R2>0,9) az NGS kísérletben kapott effektív adatokkal.A piros vonal az FRQ értéke 0,2 ng/uL (log10 = -0,7).【4】

A valós idejű kvantitatív PCR módszer az FFPE mintákon való alkalmazhatóságán túl a mintákban lévő inhibitorok hatékony monitorozására is alkalmas.A detektálandó mintát Belső Pozitív Kontroll (IPC) és annak Assay segítségével adhatjuk a reakciórendszerhez, majd fluoreszcencia kvantifikációt végezve megkapjuk a Ct értéket.Ha a minta nélküli reakcióban a Ct érték elmarad a Ct értéktől, az azt jelzi, hogy az inhibitor jelen van a mintában, és gátolja az amplifikációs hatékonyságot a reakcióban.

05 Qubit fluoreszcens festék módszer

A Qubit Fluorometer a nukleinsavkoncentráció és tisztaság kimutatására leggyakrabban használt kis eszköz, amely könnyen kezelhető és szinte minden molekuláris biológiai laboratóriumban létezik.Pontosan kiszámítja a nukleinsav koncentrációját a nukleinsavkötő fluoreszcens festék (Qubit detektáló reagens) detektálásával és nukleinsavkötőjével.A Qubit nagy érzékenységgel és specificitással rendelkezik, és pontosan képes meghatározni az RNS mennyiségét egészen pg/µL koncentrációig.A jól ismert nukleinsavkoncentráció pontos számszerűsítési képessége mellett a Thermo Fisher legújabb új modellje, a Qubit 4.0 az RNS integritását is képes kimutatni.A Qubit 4.0 RNS-detektáló rendszere (RNA IQ Assay) két specifikus fluoreszcens festék egyidejű kimutatásával érzékeli az RNS integritását.Ez a két fluoreszcens festék képes kötődni az RNS nagy és kis fragmenseihez.Ez a két fluoreszcens festék jelzi a nagy RNS-fragmensek arányát a mintában, és ebből számítható ki az RNS minőségét reprezentáló IQ (Integrity and Quality) érték.Az IQ érték FFPE és nem FFPE mintákra egyaránt alkalmazható, és nagy hatással van a későbbi szekvenálás minőségére.Az NGS-kísérleteket példának vesszük, az Ion torrent™ platformon végzett RNA-Seq tesztkísérletekben a legtöbb 4-nél nagyobb IQ-értékkel rendelkező minta legalább 50%-os hatékony leolvasást mutatott (5. ábra).A fent említett detektálási módszerekkel összehasonlítva a Qubit IQ Assay nem csak kényelmesebb és kevesebb időt vesz igénybe (5 percen belül), hanem nagy korrelációt mutat a mért paraméter IQ értéke és a downstream kísérletek adatminősége között.

Az 5. ábra nagy korrelációt mutat a Qubit RNS IQ értéke és az RNA-Seq leképezett leolvasásai között.【5】

A fenti bevezetés révén úgy gondolom, hogy mindenki kellően ismeri a különböző RNS minőségellenőrzési módszereket.A gyakorlatban választhata megfelelő módszert a minta típusának és a meglévő műszereknek megfelelően.Csak az RNS minőségének megfelelő ellenőrzésével kerülhetjük el a későbbi kísérletek rossz mintaminőség miatti kudarcát, így értékes időt, energiát és költséget takaríthatunk meg.

Referencia termékek:

Animal Total RNS Isolation Kit

Cell Total RNS Isolation Kit

hivatkozások

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.A RIN: egy RNS-integritási szám, amellyel az RNS-mérésekhez integritásértékeket rendelhetünk.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Oncomine Human Immune Repertoár Felhasználói kézikönyv (Kiadási szám: MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Enhanced Quality Metrics for Assessing RNA Derived From Archival Formalin-fixed Paraffin Embedded Tissue Samples 357–373. oldal,https://doi.org/10.1093/toxsci/