Tapasztalt gyártók vagyunk.Megszerzi a többséget piacának kulcsfontosságú tanúsítványaiban a Big Discounting China High Sensitivity One-Step Probe Rt-QpcrV2 készlet, a minőség a gyári élet, a vevői igényekre való összpontosítás a vállalat túlélésének és fejlődésének forrása, ragaszkodunk az őszinteséghez és a jóhiszemű munkavégzéshez, várjuk érkezését!
Tapasztalt gyártók vagyunk.Megszerzi a többséget a piac döntő fontosságú tanúsításaibanKínai Taq DNS-polimeráz, Qpcr, Cégünk ígéri: elfogadható árak, rövid gyártási idő és kielégítő értékesítés utáni szolgáltatás, szívesen látjuk gyárunkban bármikor, amikor csak akarja.Bárcsak most egy kellemes és hosszú távú üzletünk lenne együtt!!!

Leírások

Ez a készlet egyedülálló lízispuffer rendszert használ, amely gyorsan képes RNS-t felszabadítani a tenyésztett sejtmintákból RT-qPCR reakciókhoz, ezáltal kiküszöböli az időigényes és fáradságos RNS-tisztítási folyamatot.Az RNS-templát mindössze 7 perc alatt megszerezhető.A készletben található 5×Direct RT Mix és 2×Direct qPCR Mix-SYBR reagensek gyorsan és hatékonyan érhetik el a valós idejű kvantitatív PCR-eredményeket.

Az 5×Direct RT Mix és a 2×Direct qPCR Mix-SYBR erős inhibitortoleranciával rendelkezik, és a minták lizátuma közvetlenül használható sablonként az RT-qPCR-hez.Ez a készlet az egyedülálló RNS nagy affinitású Foregene reverz transzkriptázt és Hot D-Taq DNS polimerázt, dNTP-ket, MgCl-t tartalmazza.₂, reakciópuffer, PCR optimalizáló és stabilizátor.

Műszaki adatok

200 × 20 μl Rxns, 1000 × 20 μl Rxns

Kit összetevők

Jellemzők és előnyök

■ Egyszerű és hatékony: a Cell Direct RT technológiával mindössze 7 perc alatt RNS-mintákat lehet venni.

■ A mintaigény kicsi, akár 10 cella is tesztelhető.

■ Nagy áteresztőképesség: gyorsan képes kimutatni az RNS-t a 384, 96, 24, 12, 6 lyukú lemezeken tenyésztett sejtekben.

■ A DNS Eraser gyorsan eltávolíthatja a felszabaduló genomokat, nagymértékben csökkentve a későbbi kísérleti eredményekre gyakorolt ​​hatást.

■ Az optimalizált RT és qPCR rendszer a kétlépcsős RT-PCR reverz transzkripciót hatékonyabbá, a PCR-t specifikusabbá és az RT-qPCR reakciógátlókkal szemben ellenállóbbá teszi.

Kit alkalmazás

Alkalmazási terület: tenyésztett sejtek.

- Mintalízissel felszabaduló RNS: csak a kit RT-qPCR templátjára alkalmazható.

- A készlet a következő célokra használható: génexpressziós elemzés, siRNS-mediált géncsendesítő hatás ellenőrzése, gyógyszerszűrés stb.

Diagram

Tárolás és eltarthatóság

A készlet I. részét 4°C-on kell tárolni;A II. részt -20 ℃-on kell tárolni.

A Foregene Protease Plus II-t 4 ℃-on kell tárolni, nem fagyasztható -20 ℃-on.

A 2×Direct qPCR Mix-SYBR reagenst -20 ℃-on, sötétben kell tárolni;gyakori használat esetén 4 ℃-on is tárolható rövid ideig (10 napon belül elhasználódik). Tapasztalt gyártók vagyunk.Megszerzi a piac döntő jelentőségű tanúsítványainak többségét a nagy leárazású kínai nagy érzékenységű egylépcsős szonda Rt-Qpcr Kit V2, a minőség a gyári élet, a vevői igényekre való összpontosítás a vállalat túlélésének és fejlődésének forrása, ragaszkodunk az őszinteséghez és a jóhiszeműséghez, várjuk érkezését!
Nagy leárazásKínai Taq DNS-polimeráz, Qpcr, Cégünk ígéri: elfogadható árak, rövid gyártási idő és kielégítő értékesítés utáni szolgáltatás, szívesen látjuk gyárunkban bármikor, amikor csak akarja.Bárcsak most egy kellemes és hosszú távú üzletünk lenne együtt!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Kat. sz.DRT-01021/01022

Sejt közvetlen RT-qPCR-hez ≤ 1000 000 sejt felhasználásával

Termék bemutatása

Ez a termék egyedülálló lízispufferrendszert használ az RNS gyors felszabadítására a tenyésztett sejtmintákból az RT-qPCR reakciókhoz, kiküszöbölve az időigényes és fáradságos RNS-tisztítási folyamatot, és mindössze 7 percet vesz igénybe a szükséges RNS-templát beszerzéséhez.

Az 5× Direct RT Mix és a 2× Direct qPCR Mix-Taqman erős inhibitor toleranciával rendelkezik, és hatékony visszafordítást és specifikus amplifikációt tud végrehajtani a mérendő minta lizátumának templátként való felhasználásával.A reagens Foregene reverz transzkriptázt, Hot D-Taq DNS polimerázt, dNTP-ket, MgCl-t tartalmaz₂, Reaction Buffer, PCR Optimizer and Stabilizer, amelyek a lízis pufferrel együtt használhatók a minták gyors és egyszerű detektálására, és amelyek jellemzői a nagy érzékenység, specificitás és stabilitás.

A termék jellemzői

Egyszerű, hatékony Cell Direct RT technológia, amely mindössze 7 percet vesz igénybe az RNS-minták beszerzéséhez.

A mintaszükséglet kicsi, és a kísérletezéshez minimum 10 tenyésztett sejt használható.

Nagy áteresztőképesség a tenyésztett sejtek, például 384, 96, 24, 12 és 6 lyukú lemezek gyors RNS-szerzéséhez.

A DNA Eraser gyorsan eltávolítja a felszabaduló genomokat, nagymértékben csökkentve a későbbi kísérleti eredményekre gyakorolt ​​hatást.

Az optimalizált RT és qPCR rendszerek kétlépcsős RT-PCR-t tesznek lehetővé hatékonyabb reverz transzkripcióval, specificitással és erősebb RT-qPCR reakciógátló toleranciával.

Kit alkalmazás

Alkalmazási terület: Tenyésztett sejtek.

Mintalízis által értelmezett RNS: csak kétlépéses RT-qPCR templátként használták.

A készletek a következő célokra használhatók: génszabályozó expressziós elemzés, allélvizsgálat, gyógyszerszűrés stb.

A készlet korlátozásai

Az amplifikált fragmensek ≤ 300 bp.

A készleteket a sejtek frissen tenyésztésére használják.

Termékminőség-ellenőrzés

A FOREGENE teljes minőségirányítási rendszere szerint a Cell Direct RT-qPCR sorozatú készletek minden egyes tételét többször is szigorúan tesztelik, hogy biztosítsák az egyes készletek minőségének megbízhatóságát és stabilitását.

A készlet tartalma

*:Sejtlízis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman külön is megvásárolható, a részleteket az 1. függelék (13. OLDAL) találja.

Tárolási feltételek

1. Szállítási feltételek

Az alacsony hőmérsékletű jégtakaró dobozok szállításának teljes folyamata annak biztosítására, hogy a készlet <4 °C-os állapotban legyen.

2. Tárolási feltételek

Az I. részt 4°C-on, a II. részt -20°C-on tárolja.

A Foregene Protease Plus II-t 4°C-on kell tárolni, nem szabad lefagyasztani -20°C-on.

A 2× Direct qPCR Mix-Taqman reagenst -20°C-on, vagy 4°C-on tárolják rövid távú használat esetén, ha gyakran használják (10 napon belül).

A készlet összetevőinek információi

CL puffer: A sejtlízis reakcióihoz szükséges környezetet biztosítja.

ST puffer: Leállítja a hatóanyagot a lizátumban, hogy elkerülje a későbbi RT-re gyakorolt ​​hatást.

DNS Eraser: DNS-eltávolító, a genom eltávolításának hatása a későbbi kísérletekre.

5× Direct RT Mix: Magas RNS-affinitású Foregene reverz transzkriptázt, RNáz inhibitort, dNTP-ket, stabilizátorokat, fokozókat, optimalizálókat és reverz transzkripciós primereket tartalmaz az optimális igazodás érdekében (Random Primer, Oligo(dT)₁₈Primer).

Foregene Protease Plus II: A lízispufferrel összefüggésben a sejteket lizálják, hogy nukleinsavakat szabadítsanak fel.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: Ez a reagens Hot D-Taq DNS-polimerázt, dNTP-ket, MgCl-t tartalmaz₂, reakciópuffer, PCR optimalizáló és stabilizátor.

20× ROX referenciafesték: Általában az ABI, a Stratagene és más cégek valós idejű PCR amplifikációs műszerein használják, a PCR-csövek és a PCR-adagolási hibák okozta csövek közötti különbség beállítására szolgál.A különböző műszerekhez szükséges 20× ROX Reference Dye koncentráció eltérő, és a felhasználó a műszer ajánlott koncentrációjának megfelelően adhatja hozzá.

RNáz-mentes ddH₂O: RNáz-mentes sterilizált ultra tiszta víz kétlépcsős RT-qPCR reakciókhoz.

Óvintézkedések:(A készlet használata előtt feltétlenül olvassa el figyelmesen az óvintézkedéseket)

Ügyeljen a kísérlet működési módjára, hogy elkerülje a minták közötti keresztszennyeződést.

Ügyeljen a kísérleti környezet és az eszközök tisztaságára, hogy elkerülje az RNáz szennyeződést és az RNS lebomlását.

Vegyünk friss vagy jól konzervált sejtmintákat, és soha ne használjunk ismételt fagyasztva-olvasztott sejtmintákat.

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman kerülje az ismételt fagyasztást-olvasztást, különben befolyásolja a reverz transzkripciót és a PCR hatékonyságát.

Prepaadagokatelőttművelet

A készlet használata előtt feltétlenül olvassa el figyelmesen az utasításokat.A Cell Direct RT-qPCR készlet egyszerű, kényelmes és gyorsan használható, az útmutató pedig teljes körű tájékoztatást nyújt a teljes készletről és annak helyes használatáról.Kérjük, használat előtt készítse elő a szükséges kísérleti anyagokat és eszközöket.

Kísérleti anyagok és berendezések

◆ Sejttenyésztés.

◆ 1,5 ml vagy 2 ml, RNáz-/DNáz-mentes centrifugacső, RNáz-/DNáz-mentes hegy, 0,2 ml-es steril qPCR-cső.

◆ qPCR gép, pipetta, asztali centrifuga (≥13 400×g) (kísérleti igények függvényében) stb.

Biztonság

◆ Ez a termék kizárólag tudományos kutatási célokra szolgál, kérjük, ne használja gyógyszerészeti, klinikai, élelmiszeripari és kozmetikai célokra.

◆ Vegyszerek használatakor viseljen megfelelő laboratóriumi ruhát, kesztyűt, védőszemüveget stb.

Műveletútmutatók

A sejtlízis rendszerek, az RT rendszerek és a qPCR reakcióoldat-kiegészítő csomagok külön megvásárolhatók, a részleteket az 1. függelékben találja (13. OLDAL).

Használati útmutató

V: Minta RNS felszabadulása

1. A sejteket előkezeltük: Mossa meg a sejttenyésztő lemezt hideg PBS-sel, majd lizálja a sejteket (10-10⁶), 10⁶ mint a sejtek mennyisége, ajánlott Foregene the Cell an RNA Isolation Kit a Total (DE-03111) vagy Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) RNS extrakcióhoz és tisztításhoz.

1.1.Tapadó sejtek (példaként 24 lyukú lemez)

1.1.1.Határozza meg a sejtek számát az egyes üregekben, és határozza meg, hogy a sejtek száma 1 × 10⁵, és pipettával távolítsa el a táptalajt a táptalajból.

1.1.2.Adjon 200 μl előhűtött 1 × PBS-t mindegyik lyukba.Ne pipettázzon többször, és távolítsa el a PBS-t a lyukakból.Döntse meg a lemezt, és távolítson el annyi PBS-t, amennyit csak lehetséges.Folytassa a 2. lépéssel.

1.1.3.Különböző sejttenyésztő edényt vagy egy sejttenyésztő edényben lévő 1-1. hivatkozási számtáblázatot adtunk hozzá előhűtött 1 × PBS-sel a sejtmosáshoz.

1-1. táblázat: PBS adagolása különböző számú sejthez

jegyzet:A szilárdan tapadó sejtek biztosítása érdekében，mosáskor elkerülhető a nagyszámú sejtvesztés.

1.2.Nem porózus lemezeken tenyésztett szuszpenziós sejtek vagy adherens sejtek

1.2.1.Nem többlyukú lemezeken tenyésztett tapadó sejteket (a szuszpenziós sejtek a következő 1.2.2. lépéstől indulnak), gyűjtsük össze és különítsük el a sejteket a normál sejtgyűjtési módszer szerint, és helyezzük tenyésztőlemezbe vagy centrifugacsőbe;ha tripszinezést alkalmaznak, centrifugálás szükséges a sejtek összegyűjtéséhez és a maradék tripszin eltávolításához, a sejtek diszpergálásához adjon hozzá PBS-sel újraszuszpendált sejteket az egyes sejtekhez.

1.2.2.A megszámlált sejtek száma után a sejteket 1×10 aliquot részekre osztjuk⁵ 1. centrifugálás csövek, gyűjtsük össze a sejteket centrifugálással 1000 × g-vel 10 percig.

1.2.3.Adjon hozzá 200 μl PBS-t a centrifugacsőhöz, ne pipettázzon többször, és szívja le közvetlenül a PBS-t.folytassa a 2. lépéssel. (Ha nehéz kicsapni, és a sejteket újra felszuszpendálták, elvégezhető 1000 × g-vel centrifugálva 10 perccel a felülúszó eldobása után, a sejtpelletet a 2. lépéssel kell folytatni.)

2. Sejtlízis: Távolítsa el a szobahőmérsékletre kiegyenlített CL puffert, a DNA Erasert és a Foregene Protease Plus II-t, a következő 1-2. táblázat szerint elkészített lízisrendszer: (A lízisoldat használatra kész).

1-2. táblázat: hasítás rendszer előkészítése (Megjegyzés: jégen történő előkészítésnél)

3. (Példaként 24 lyukú lemez) Pipettázzunk 200 μl sejtlízis mesterkeveréket minden egyes lyukba, fújjuk meg ismételten 5-10-szer, inkubáljuk szobahőmérsékleten (20-25 ℃) 5 percig.

jegyzet:A buborékok képződésének elkerülése érdekében kérjük, hogy pipettázáskor a pipettát 200 μl-re vagy kevesebbre állítsa be.A sejtek zavarosnak tűnhetnek a lízis után, ami normális.

4. (példaként 24 lyukú lemezt) adunk a folyadékhoz 20 μl ST puffert (különböző lízisrendszerek ST puffert adunk hozzá az 1-3. táblázatban látható mennyiségben), majd 5-10-szer ismételjük pipettával, szobahőmérsékleten (20-25 ℃) 2 percig inkubáljuk.

jegyzet:A pipetta hegye a felület alatt helyezkedett el, biztosítva a lizátum hozzáadását，a buborékok képződésének elkerülése érdekében kérjük, pipettázáskor a pipettát 200 μl-re vagy kevesebbre állítsa be.

táblázat 1-3:Add puffer ST

5. A lizátumot a következő RT-qPCR kísérletekhez használjuk fel.Ha a további kísérleteket nem lehet időben elvégezni, kérjük, tartsa jégen legfeljebb 2 óráig, és tárolja -20 ℃ vagy -80 ℃ hőmérsékleten (legfeljebb három hónapig).

B: RT rendszer előkészítése

1. Vegye ki az 5 × Direct RT Mix-et, és helyezze jeges fürdőre, hagyja természetesen felolvadni, majd óvatosan keverje össze későbbi felhasználáshoz;vegye ki az RNase-Free ddH2O-t, olvassa fel, majd tegye jégfürdőre későbbi felhasználásra.Készítse elő a reakciórendszert jégen az alábbi 2-1. táblázat szerint.

2-1. táblázat: RT reakciórendszer előállítása

2. A rendszerformálás befejezése után óvatosan keverje össze és centrifugálja röviden a következő táblázatban: 2 -2 reakciókörülmények RT reakció.

2-2. táblázat: RT Reakciófeltétel beállítása

3. A reakció befejeződése után a reakcióterméket közvetlenül jégre helyezték a qPCR-hez, kérjük, tegye a hosszú távú tartósítást -20 ℃ vagy -80 ℃ hőmérsékletre.

Megjegyzés: A nem tisztított templát használata miatt fehér csapadék jelenhet meg a fordított transzkripciós termékben.Ez normális jelenség.A következő kísérletekhez azonnal centrifugálja a felülúszót.

Az így kapott RT reakcióoldatot a következő lépéshez adjuk a Real Time PCR reakciórendszerhez, javasolt a reakciórendszer 10-30%-a közötti mennyiséget hozzáadni.

C: qPCR reakciórendszer előkészítése

1. Megfelelő mennyiségű B a cDNS templát lépésben a következő 3-1. táblázat szerint előállítva egy reakciórendszer elkészítéséhez.

Megjegyzés: A cDNS templát mennyisége a qPCR rendszer 10-30%-át teszi ki.Például egy 20 μl-es qPCR rendszerben adjon hozzá 2-6 μl lízispuffert, de legfeljebb 6 μl-t.

2. A jó qPCR-körülmények optimalizálása (Annealing hőmérséklet, stb.) a qPCR reakcióhoz (A reakciókörülmények a 3-2. táblázatban vannak megadva).

Megjegyzés: A jobb eredmények érdekében próbáljon meg optimalizált körülményeket használni a qPCR reakciókhoz.

3-1. táblázat: PCR reakciórendszer előállítása

1*: A primer koncentrációja 50-900 nM tartományban állítható be, ha a primer reakció teljesítménye gyenge.

Megjegyzés: A qPCR rendszer a kísérleti igényeknek és a fluoreszcencia ciklusos modellnek megfelelően állítható.qPCR-hez 50-benμl rendszerben állítsa be a reagens adagolását arányosan a 20μl rendszer.

2*: Válassza ki a ROX Reference Dye megfelelő végső koncentrációját a fluoreszcencia kvantitatív hőciklusának megfelelően.Az alábbi táblázatban láthatók a legmegfelelőbb ROX referenciafesték-koncentrációk a szokásos fluoreszcens kvantitatív ciklusokhoz:

3-2. táblázat: A qPCR reakciókörülmények megadva

Megjegyzés: A legjobb qPCR hatás elérése érdekében a gradiens PCR használható a reakciókörülmények optimalizálására különböző templátokhoz és különböző primerekhez.A PCR reakciókörülményei a fluoreszcenciaanalizátortól, templáttól, primertől stb. függően változnak. Az adott műveletben az optimális reakciókörülményeket a fluoreszcencia kvantitatív hőciklusának, a templát típusának, a kérdéses fragmens méretének, az amplifikált fragmens bázissorrendjének és a GC-tartalomnak és a primerek hosszának, beleértve az annealing hőmérsékletet, stb. függvényében kell megtervezni.

Valós idejű PCR primer tervezési elvek

Forward Primer és Reverse Primer

A valós idejű PCR-nél a primer tervezése nagyon fontos.A primerek a PCR-amplifikáció specifitásához és hatékonyságához kapcsolódnak, és a következő elvek alapján tervezhetők:

◆ Alapozó hossza: 18-30 bp.

◆ GC tartalom: 40-60%.

◆ Tm érték: Primer tervező szoftver, mint például a Primer 5, meg tudja adni az alapozó Tm értékét.Az upstream és a downstream primerek Tm értékeinek a lehető legközelebb kell lenniük.A Tm számítási képlet is használható: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).A PCR végrehajtásakor általában az 5 °C-os primer Tm értéke alatti hőmérsékletet választjuk annealing hőmérsékletként (az összekeverési hőmérséklet megfelelő emelkedése növelheti a PCR reakció specificitását).

◆ Primerek és PCR termékek:

◆ A tervezési primer PCR amplifikációs termék hossza előnyösen 100-150 bp.

◆ A sablon másodlagos szerkezeti területén a tervezési alapozókat lehetőleg kerülni kell.

◆ Kerülje el 2 vagy több komplementer bázis képződését az upstream és a downstream primerek 3′ végei között.

◆ A Primer 3′ csatlakozóaljzata nem lehet jelen további 3 egymást követő G-vel vagy C-vel.

◆ Maguknak a primereknek nem lehet komplementer szerkezetük, különben hajtűs szerkezet alakul ki, ami befolyásolja a PCR amplifikációt.

◆ Az ATCG-t a lehető legegyenletesebben kell elosztani a primer szekvenciában, és a 3′ terminális bázist kerülni kell T-ként.

Függelék1:Cell KözvetlenRT-qPCR Kit összetevőt kiegészítő csomag

1. Sejtlízis oldat