Escherichia Coli O157: H7 nukleinsav-detektáló készlet (PCR fluoreszcens szonda módszer/liofilizálás)
A készlet leírása:
Cat.No.FP103
Az E. coli O157:H7 gyors kimutatására és szűrésére használják élelmiszer-, takarmány-, vízmintákban és környezeti mintákban.
Leírások
Arra használjákaz E. coli O157:H7 gyors kimutatása és szűrése élelmiszerekben, takarmányokban, vízmintákban és környezeti mintákban.
[Tesztelési elv]
A fluoreszcens PCR technológia elve szerint az Escherichia coli O157: H7 specifikus génjére specifikus primereket és Taqman próbákat terveznek, és fluoreszcens PCR készülékkel detektálják, hogy megvalósítsák az Escherichia coli O157: H7 DNS kvalitatív kimutatását.
A készlet tartalma
Megjegyzés: ROX csatorna szonda nem tartozék.
| Ckomponensek | Leírás | Qegységnyi |
| A puffer | Cső | 1 |
| B puffer | Cső | 1 |
| Pozitív kontroll | Cső | 1 |
| Negatív kontroll | Cső | 1 |
Várható használat
Arra használják az E. coli O157:H7 gyors kimutatása és szűrése élelmiszerekben, takarmányokban, vízmintákban és környezeti mintákban.
Tárolási feltételek és lejárati idő
Tárolja -20 ℃-on, sötétben, és kerülje az ismételt fagyasztást és felengedést.
Az érvényességi idő 12hónap, és a gyártás dátuma a külső csomagoláson látható.
Műszerek és fogyóeszközök
Fluoreszcens kvantitatív PCR műszer, pipettapisztoly és megfelelő hegyek, vortex shaker, mini centrifuga.
Használat
1. Mintafeldolgozás
1.1 Minta típusa: Ez a készlet élelmiszer-, takarmány-, vízminták és egyéb olyan minták tárolására alkalmas, amelyekről feltételezhető, hogy Escherichia coli O157:H7 fertőzöttek.A mélyen feldolgozott húskészítmények, italok és egyéb pigmenteket tartalmazó anyagok esetében ezeket le kell öblíteni, hogy elkerüljék a fluoreszcencia jelek gyűjtését.
1.2 Mintafeldolgozás: Lásd a "GB 4789.10-2016 Élelmiszerbiztonsági Nemzeti Szabvány Élelmiszer-mikrobiológiai vizsgálat az Escherichia coli O157: H7 teszt" című dokumentumot a minta-előkészítésről, a dúsító tenyésztésről és az Escherichia coli O157: H7 izolálásáról.
- Nucleinsav extrakció
Vegyen 20 ml dúsító oldatot egy 1,5 ml-es centrifugacsőbe, adjon hozzá 200 μL mikrobiális lizátumot (kiegészítő készlet szükséges), forgassa 30 másodpercig, centrifugálja röviden, és tegye félre.
Megjegyzés: A lizátumból a nukleinsav extrakcióját 10 percen belül be kell fejezni, és hosszú ideig nem tárolható.
3. Nukleinsav-amplifikáció
3.1 Használathoz kapcsolja be a fluoreszcens kvantitatív PCR készüléket.
A és B puffer a készletből, olvassa fel alaposan, és centrifugálja röviden.Adjon 18 μL A puffert és 2 μL B puffert minden PCR reakciócsőhöz.Ezután adjon 5-5 ml negatív kontrollt, extrahált nukleinsavat és pozitív kontrollt a PCR reakciócsövekbe, zárja le a csöveket, és röviden centrifugálja.
3.3 Vigye át a PCR reakciócsövet egy fluoreszcens PCR gépbe, és használja a következő eljárásokat az amplifikációs kísérletek végrehajtásához: válasszon 25 ml-t a reakciórendszerhez, gyűjtse össze a fluoreszcens jeleket 60 °C-on minden ciklusban, és válassza ki a FAM-ot a detektálási csatornának.
| Lépés | Program | Ciklusok száma |
| 1 | 37℃ 5 perc | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3 perc | 1 |
| 3 | 95°C 15s | 4 0 |
| 60 ℃ 30 s (fluoreszcenciát gyűjt) |
Útmutató a problémák elemzéséhez
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
Nem lehet RNS-t kivonni, vagy a nukleinsav hozama alacsony
Általában sok tényező befolyásolja a visszanyerés hatékonyságát, például: minta RNS-tartalma, működési módja, elúciós térfogat stb.
A gyakori okok elemzése:
1.Jégfürdő vagy alacsony hőmérsékletű (4 °C) centrifugálás működés közben.
Javaslat: Szobahőmérsékletű (15-25°C) üzemmód, soha ne használjon jeges fürdőt és alacsony hőmérsékletű centrifugát.
2. Nem megfelelő mintatárolás vagy túl hosszú mintatárolás.
Javaslat: Tárolja a mintákat -80 °C-on vagy fagyassza le folyékony nitrogénben, és kerülje az ismételt fagyasztás-olvasztás használatát;próbáljon meg frissen gyűjtött mintákat használni az RNS-kivonáshoz.
3. A minta elégtelen lízise
Javaslat: Győződjön meg arról, hogy a mintát és a munkaoldatot (Lineáris Akrilamid) alaposan összekeverte, és 10 percig szobahőmérsékleten (15-25 °C) inkubálja.
4. Az eluenst helytelenül adtuk hozzá
Javaslat: Ügyeljen arra, hogy RNase-Free ddH2O-t adjon a tisztító oszlop membránjának közepéhez.
5. Nem megfelelő mennyiségű vízmentes etanol a viRW2 pufferben
Javaslat: Kérjük, kövesse az utasításokat, adjon hozzá megfelelő mennyiségű vízmentes etanolt a viRW2 pufferhez, és jól keverje össze a készlet használata előtt.
6. Helytelen mintahasználat.
Javaslat: 200 µl minta 500 µl puffer viRL-hez.A túlzott mintatérfogat csökkenti az RNS extrakciós sebességét.
7.Nem megfelelő elúciós térfogat vagy nem teljes elúció.
Javaslat: A tisztító oszlop eluens térfogata 30-50μl;ha az elúciós hatás nem kielégítő, ajánlott előmelegített RNáz-mentes ddH hozzáadása2O és hosszabbítsa meg a szobahőmérsékletre helyezés idejét, például 5-10 perccel
8. A tisztítóoszlop viRW2 pufferrel történő öblítés után etanolmaradékot tartalmaz.
Javaslat: Ha a viRW2 pufferben történő öblítés és 2 perces üres csöves centrifugálás után továbbra is etanol marad, a tisztító oszlopot az üres csöves centrifugálás után 5 percig szobahőmérsékleten hagyhatja a maradék etanol teljes eltávolítása érdekében.
A tisztított RNS-molekulák lebontása
A tisztított RNS minősége olyan tényezőktől függ, mint a minta tárolása, az RNáz szennyezettsége és a működés.
A gyakori okok elemzése:
1.A begyűjtött mintákat nem mentettük el időben.
Javaslat: Ha a mintát a begyűjtés után nem használja fel időben, azonnal tárolja -80 ℃-on vagy folyékony nitrogénben.Az RNS-molekulák kinyeréséhez lehetőség szerint próbáljon meg frissen gyűjtött mintákat használni.
2. Az összegyűjtött mintákat többször fagyasztották és felengedték.
Javaslat: Kerülje az ismételt fagyasztást és felengedést (legfeljebb egyszer) a mintagyűjtés és -tárolás során, ellenkező esetben csökken a nukleinsav hozama.
3. Az RNase-t bevezették a műtőbe, vagy nem viseltek eldobható kesztyűt, maszkot stb.
Javaslat: Az RNS molekulák extrakciós kísérletét célszerű külön RNS-műtőben végezni, és a kísérleti asztalt a kísérlet előtt le kell tisztítani.Viseljen eldobható kesztyűt és maszkot a kísérlet során, hogy elkerülje az RNáz bejutása által okozott RNS lebomlását.
4. A reagenst a használat során RNáz szennyezi.
Javaslat: Cserélje ki az új Viral RNA Isolation Kit-et a kapcsolódó kísérletekhez.
5.A centrifugacsövek, pipettahegyek stb. RNáz-szennyezése. Javaslat: Győződjön meg arról, hogy a centrifugacsövek, pipettahegyek és pipetták mindegyike RNáz-mentes.
A tisztított RNS-molekulák hatással voltak a downstream kísérletekre
A tisztítóoszlopon tisztított RNS-molekulák befolyásolják a downstream kísérleteket, ha túl sok sóion vagy fehérje van, például: reverz transzkripció, Northern Blot stb.
1.Az eluált RNS-molekulákban megmaradt sóionok vannak.
Javaslat: Győződjön meg arról, hogy a megfelelő mennyiségű vízmentes etanolt adták a viRW2 pufferhez, és mossa át a tisztítóoszlopot kétszer a megfelelő centrifugálási sebességnek megfelelően a kezelési útmutatóban. Ha még vannak sóionok, adjon hozzá puffer viRW2-t a tisztítóoszlophoz, és hagyja szobahőmérsékleten 5 percig.Ezután végezze el a centrifugálást, hogy a sóionok szennyeződését a lehető legnagyobb mértékben eltávolítsa
2.Az eluált RNS-molekulákban etanol maradt
Javaslat: miután megbizonyosodott arról, hogy a tisztítóoszlopokat átöblítette a puffer viRW2, végezze el az üres csöves centrifugálást a kezelési útmutatóban megadott centrifugális sebességnek megfelelően.Ha még maradt etanol, akkor üres csöves centrifugálás után 5 percig szobahőmérsékleten hagyhatjuk, hogy a maradék etanolt a lehető legnagyobb mértékben eltávolítsuk.
Használati útmutatók:
Vírusos RNS izolációs készlet használati útmutatója
