1. Kezdeti megértés

Ebben a szakaszban meg kell értenünk néhány fogalmat és terminológiát, hogy elkerüljük az idősek előtti hibákat, mint például:

K: Mi a különbség az RT-PCR, a qPCR, a valós idejű PCR és a valós idejű RT-PCR között?

Válasz: Az RT-PCR reverz transzkripciós PCR(reverz transzkripciós PCR, RT-PCR), amely a polimeráz láncreakció (PCR) széles körben használt változata.Az RT-PCR során egy RNS-szálat reverz transzkripcióval komplementer DNS-vé írnak át, amelyet azután templátként használnak a DNS-amplifikációhoz PCR-rel.
Valós idejű PCR és qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) ugyanaz, mindkettő valós idejű kvantitatív PCR, ami azt jelenti, hogy a PCR minden ciklusa valós idejű adatrekordokkal rendelkezik, így a kiindulási sablonok száma precíz elemzéssel állítható.

Bár úgy tűnik, hogy a valós idejű PCR (valós idejű fluoreszcens kvantitatív PCR) és a reverz transzkripciós PCR (reverz transzkripciós PCR) rövidítése RT-PCR, a nemzetközi egyezmény a következő: Az RT-PCR kifejezetten a reverz transzkripcióra vonatkozik.PCR, a valós idejű PCR rövidítése általában qPCR (quantitative real-time PCR).

És a valós idejű RT-PCR (RT-qPCR), ez a fordított transzkripciós PCR fluoreszcens kvantitatív technológiával kombinálva: először szerezzen be cDNS-t (RT) az RNS reverz transzkripciójából, majd használja a valós idejű PCR-t kvantitatív elemzéshez (qPCR).A legtöbb laboratórium RT-qPCR-t végez, vagyis az RNS expresszió leszabályozását kutatja, így a qPCR, amelyről mindenki beszél a laboratóriumban, valójában az RT-qPCR-re vonatkozik, de ne felejtsük el, hogy még mindig sok DNS-teszt létezik a klinikai alkalmazásokban.Kvantitatív elemzés, mint például a hepatitis B vírus HBV kimutatása.

Kérdés: Sok fluoreszcens kvantitatív PCR leolvasása után miért kell az amplifikált fragmenst 80-300 bp tartományban szabályozni?

Válasz: Az egyes génszekvenciák hossza eltérő, van, amelyik több kb, van, amelyik több száz bp, de a primerek tervezésekor csak 80-300 bp termékhosszt kell megkövetelnünk, a túl rövid vagy túl hosszú nem alkalmas fluoreszcens kvantitatív PCR kimutatásra.A termékfragmens túl rövid ahhoz, hogy meg lehessen különböztetni a primer-dimertől.A primer-dimer hossza körülbelül 30-40 bp, és nehéz megkülönböztetni, hogy primer-dimer-e vagy termék, ha 80 bp-nál kisebb.Ha a termékfragmens túl hosszú, meghaladja a 300 bp-t, könnyen alacsony amplifikációs hatékonysághoz vezet, és nem tudja hatékonyan kimutatni a gén mennyiségét.

Például, amikor megszámolja, hány ember van egy osztályteremben, csak azt kell megszámolnia, hogy hány száj van.Ugyanez igaz a gének kimutatására is, csak egy gén egy bizonyos szekvenciáját kell kimutatnia ahhoz, hogy a teljes szekvencia megfeleljen.Ha embereket akarsz számolni, akkor a szájat és az orrot, a fület és a szemüveget is meg kell számolnod, és könnyű hibázni.

Bővítendő, a biológiai kutatásban számos kutatási eset van pontról területre, mivel bármely faj génszekvenciája nagyon hosszú, szükségtelen és lehetetlen minden fragmentumot megmérni, mint például a bakteriális 16S szekvenálás, ami a baktériumok konzervatív szekvenciájának elvégzését jelenti.

K: Mi az optimális hosszúság a qPCR primer tervezéshez?

Válasz: Általánosságban elmondható, hogy a primer hossza körülbelül 20-24 bp, ami jobb.Természetesen az alapozó tervezésekor ügyelni kell az alapozó TM értékére, mert ez összefügg az optimális lágyítási hőmérséklettel.Sok kísérlet után bebizonyosodott, hogy a 60°C jobb TM érték.Ha a lágyítási hőmérséklet túl alacsony, az könnyen nem specifikus erősítéshez vezet.Ha a lágyítási hőmérséklet túl magas, akkor az amplifikációs hatásfok viszonylag alacsony lesz, az amplifikációs görbe csúcsa később kezdődik, és a CT érték késik.

K: Miben különbözik a festékmódszer a szonda módszerétől?

Válasz: Festék módszerEgyes fluoreszcens festékek, mint például a SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO stb., önmagukban nem bocsátanak ki fényt, de fluoreszcenciát bocsátanak ki, miután a kétszálú DNS kisebb barázdájához kötődnek.Ezért a PCR-reakció kezdetén a gép nem tudja érzékelni a fluoreszcens jelet.Amikor a reakció eléri az annealing-extension szakaszt, a kettős szál kinyílik, és a DNS polimeráz hatására új szál szintetizálódik, és a fluoreszcens molekula a dsDNS minor barázdához kötődik.A PCR-ciklusok számának növekedésével egyre több festéket kombinálnak kétszálú DNS-sel, és a fluoreszcens jel is folyamatosan erősödik.A festékmódszert főként tudományos kutatásban alkalmazzák.
PS: Legyen óvatos a kísérlet során, a festéket emberi DNS-sel kell kombinálni, ügyeljen arra, hogy fluoreszkáló személy legyen.

Festékmódszer (balra) Próbamódszer (jobbra)
PS: Legyen óvatos a kísérlet során, a festéket emberi DNS-sel kell kombinálni, ügyeljen arra, hogy fluoreszkáló személy legyen.

A SYBR Green Ⅰ a DNS kisebb barázdájához kötődik

Szonda módszerA Taqman szonda a leggyakrabban használt hidrolízisszonda.A próba 5′ végén található egy fluoreszcens csoport, általában FAM, és maga a próba a célgénnel komplementer szekvencia.A 3′ végén egy fluoreszcens kioltócsoport található.A fluoreszcencia rezonancia energiatranszfer (Förster resonance energy transfer, FRET) elve szerint, amikor a riporter fluoreszcens csoport (donor fluoreszcens molekula) és a kioltó fluoreszcens csoport (akceptor fluoreszcens molekula) gerjesztett Ha a spektrumok átfedik egymást és a molekula távolsága nagyon közel van (7-10 nm) a donor fluoreszcens akceptálási tartományában. ule, míg az autofluoreszcencia gyengül.Ezért a PCR-reakció elején, amikor a próba szabad és sértetlen a rendszerben, a riporter fluoreszcens csoport nem bocsát ki fluoreszcenciát.A lágyítás során a primer és a szonda a sablonhoz kötődik.A kiterjesztési szakaszban a polimeráz folyamatosan új láncokat szintetizál.A DNS polimeráz 5′-3′ exonukleáz aktivitással rendelkezik.Amikor eléri a próbát, a DNS-polimeráz hidrolizálja a próbát a templátról, elválasztja a riporter fluoreszcens csoportot a kioltó fluoreszcens csoporttól, és felszabadítja a fluoreszcens jelet.Mivel a próba és a sablon között egy az egyhez kapcsolat van, a próbamódszer a teszt pontosságát és érzékenységét tekintve felülmúlja a festékmódszert.A szondás módszert elsősorban a diagnosztikában használják.

K: Mi az abszolút számszerűsítés?Mi az a relatív mennyiségi meghatározás?

Válasz: Az abszolút mennyiségi meghatározás a qPCR-rel vizsgálandó minta kezdeti kópiaszámának kiszámítására vonatkozik, például arra, hogy hány HBV vírus van 1 ml vérben.A relatív kvantifikációval kapott eredmény egy adott mintában a célgén mennyiségének változása egy másik referenciamintához képest, és a génexpresszió felfelé vagy lefelé szabályozott.

K: Az RNS extrakció mennyisége, a reverz transzkripció hatékonysága és az amplifikáció hatékonysága befolyásolja-e a kísérleti eredményeket?
K: A mintatárolás, az extrakciós reagensek, a reverz transzkripciós reagensek és a fényáteresztő fogyóeszközök befolyásolják-e a kísérleti eredményeket?
K: Milyen módszerrel lehet korrigálni a kísérleti adatokat?

Ezekkel a problémákkal kapcsolatban részletesen ismertetjük őket az alábbi speciális és haladó szakaszokban.
2. Fejlett tudás

A valós idejű fluoreszcens kvantitatív PCR kapcsán fel kell ismernünk azt a tényt, hogy évente több ezer tudományos kutatás jelenik meg, amelyek között nem kevés a fluoreszcens kvantitatív PCR technológia.

Ha nincs közös szabvány a fluoreszcens kvantitatív PCR-kísérlet mérésére, az eredmények nagyon eltérőek lehetnek.Ugyanazon faj ugyanazon génjénél, azonos feldolgozási módszerrel a kimutatási eredmények is nagyon eltérőek lesznek, és a későn érkezők számára nehéz lesz megismételni ugyanazokat az eredményeket.Senki sem tudja, mi a helyes és melyik a helytelen.

Ez azt jelenti, hogy a fluoreszcens kvantitatív PCR csaló technológia vagy megbízhatatlan technológia?Nem, ez azért van, mert a fluoreszcens kvantitatív PCR érzékenyebb és pontosabb, és egy kis helytelen művelet teljesen ellentétes eredményt eredményez.Egy kis veszteség ezer mérföldre van.A cikk szerzőjét többször is megkínozhatják a bírálók.Ugyanakkor a folyóirat lektorainak is nehéz választani a különböző kísérleti eredmények közül.

Mindent összevetve, rámutatva a konszenzus hiányára a valós idejű PCR-kísérletekben.Ennek érdekében az iparág vezető tudósai szabványokat kezdtek megfogalmazni,megköveteli a közreműködőktől, hogy adjanak meg néhány szükséges kísérleti és adatfeldolgozási részletet (beleértve a szükséges adatokat is) a cikkben, hogy megfeleljenek ezeknek a szabványoknak.

A bírálók ezen részletek elolvasásával megítélhetik a kísérlet minőségét;a jövőbeni olvasók ezt is felhasználhatják a kísérlet megismétlésére vagy a kísérlet javítására.Ekkor az így kapott kísérleti eredmények információval teli, kiváló minőségűek, használhatók.

MIBBI (Minimális információ biológiai és orvosbiológiai vizsgálatokhoz -http://www.mibbi.org) létrejött.A MIBBI egy olyan projekt, amely szabványokat biztosít a kísérletekhez.A természetben kiadják.Ez a projekt különféle biológiai kísérletekre irányul, beleértve a sejtbiológiát, a Microarray-t, a qPCR-t, amelyet most tárgyalunk stb., és minden kísérlettípust előír a kéziratok benyújtásakor.Ezt az információt mindenkor meg kell adni.

A MIBBI projektben két cikk kapcsolódik a fluoreszcens kvantitatív PCR-hez, nevezetesen:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – strukturált nyelvi és jelentéskészítési útmutató a valós idejű kvantitatív PCR adatokhoz;
·MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) – minimális információ a valós idejű kvantitatív PCR-kísérletekről szóló cikkek közzétételéhez.
Először is beszéljünk az RDML-ről, a terminológiai specifikációról.

Ha nincs mindenre egységes definíció, akkor lehetetlen a vitát folytatni, ezért is olyan fontos a terminusok magyarázata a vizsgán.
A fluoreszcens kvantitatív PCR-kísérletben használt terminológia a következő tartalmat tartalmazza.A QIAGEN elkészítette számunkra a legjobb összefoglalót.A következők mind szárazakáruk .

Erősítési görbe
Az amplifikációs görbe a PCR-folyamat során készített görbére vonatkozik, ahol a ciklusszám az abszcissza, a valós idejű fluoreszcencia intenzitás pedig a reakció során az ordináta.

Egy kiváló erősítési görbének a következő jellemzőkkel kell rendelkeznie: az alapvonal lapos vagy enyhén csökkent, és nincs nyilvánvaló emelkedő tendencia;a görbe inflexiós pontja egyértelmű, az exponenciális fázis meredeksége arányos az erősítési hatásfokkal.Minél nagyobb a meredekség, annál nagyobb az erősítési hatékonyság;a teljes erősítési görbe A párhuzamosság jó, ami azt jelzi, hogy az egyes csövek erősítési hatékonysága hasonló;az alacsony koncentrációjú minták amplifikációs görbéjének exponenciális fázisa nyilvánvaló.

Alapvonal (alapvonal)
Az alapérték a korai ciklus zajszintje, általában a 3. és 15. ciklus között mérik, mert az amplifikációs termék okozta fluoreszcencia érték növekedés ebben az időszakban nem mutatható ki.Az alapvonal kiszámításához használt ciklusok száma változhat, és csökkenteni kell, ha nagy templátmennyiséget használunk, vagy ha a célgén expressziós szintje magas.

Az alapvonal beállításához meg kell tekinteni a fluoreszcencia adatokat a linearitási amplifikációs görbéről.Az alapvonal úgy van beállítva, hogy az amplifikációs görbe növekedése az alapvonal ciklus felső számánál nagyobb ciklusszámmal kezdődik.Az alapvonalakat minden egyes célszekvenciához külön kell beállítani.A korai ciklusokban kimutatott átlagos fluoreszcencia értékeket le kell vonni az amplifikált termékekben kapott fluoreszcencia értékekből.A különféle Real-Time PCR szoftverek legújabb verziói lehetővé teszik az egyes minták alapbeállításainak automatikus optimalizálását.

A PCR amplifikációs reakció első néhány ciklusában a fluoreszcencia jel nem sokat változik.Az egyenes vonal megközelítését alapvonalnak nevezzük, de ha alaposan megnézzük az első néhány ciklust, azt látjuk, hogy az alapvonalon belül az történik, ami az alábbi képen történik.

Háttér A háttér arra utal
a reakció nem specifikus fluoreszcencia értéke .Például: nem hatékony fluoreszcens kioltás;vagy nagyszámú kétszálú DNS templát a SYBR Green alkalmazása miatt.A jel háttérkomponenseit a Real-Time PCR szoftveralgoritmus matematikailag eltávolítja.

Riporter jelzés
A riporter jel a SYBR Green vagy fluoreszcensen jelölt szekvencia-specifikus próbák által generált fluoreszcens jelre vonatkozik a valós idejű PCR során.

Normalizált riporter jel (RN)
Az RN a riporterfesték fluoreszcencia intenzitása osztva a passzív referenciafesték minden ciklusban mért fluoreszcencia intenzitásával.

Passzív referenciafesték
Egyes valós idejű PCR-ekbena ROX fluoreszcens festéket belső referenciaként használják a fluoreszcens jel normalizálására.A pontatlan pipettázás, a lyuk helyzete és a fluoreszcencia ingadozások miatti eltéréseket kútról üregre korrigálja.

A fluoreszcencia küszöb (threshold)
Az amplifikációs görbe háttérértéke fölé és szignifikánsan az amplifikációs görbe platóértéke alá volt igazítva.Az amplifikációs görbe lineáris tartományában kell lennie, ami a PCR kimutatás log-lineáris tartományát jelenti.A küszöbértékeket a log-amplifikációs görbe nézetben kell beállítani, hogy a PCR log-lineáris fázisa könnyen azonosítható legyen.Ha több célgén is van a valós idejű PCR-ben, a küszöbértéket minden egyes célponthoz be kell állítani.Általában a PCR-reakció első 15 ciklusának fluoreszcencia jelét használjuk fluoreszcencia háttérjelként, és a fluoreszcencia küszöbérték a PCR első 3-15 ciklusának fluoreszcencia jelének szórásának 10-szerese, a fluoreszcencia küszöbértéket pedig a PCR exponenciális amplifikálási fázisában állítjuk be.Általánosságban elmondható, hogy minden műszer használat előtt beállítja a fluoreszcencia küszöbét.

Ciklusküszöb (CT) vagy keresztezési pont (CP)
Az a ciklus, amelynél az amplifikációs görbe átlépi a küszöböt (azaz azt a pontot, ahol a fluoreszcencia-detektálás jelentősen megnő).A CT lehet töredék, és a kiindulási sablon mennyisége kiszámítható.A CT érték azoknak a ciklusoknak a számát jelenti, amelyek akkor tapasztalhatók meg, amikor a fluoreszcens jel az egyes PCR reakciócsövekben eléri a beállított küszöböt.Az egyes sablonok CT értéke és a sablon kezdeti példányszámának logaritmusa között lineáris kapcsolat van, aminél nagyobb a kezdeti másolatszám, annál kisebb a CT-érték, és fordítva.Egy ismert kezdeti másolatszámú szabvány használatával standard görbe készíthető, ahol az abszcissza a CT értéket, az ordináta pedig a kezdeti másolatszám logaritmusát jelenti.Ezért mindaddig, amíg az ismeretlen minta CT-értékét megkapjuk, a minta kezdeti példányszáma kiszámítható a standard görbéből.

ΔCT érték
A ΔCT érték leírjaa célgén és a megfelelő endogén referenciagén CT-értéke közötti különbség, mint például egy háztartási gén, és a felhasznált sablon mennyiségének normalizálására szolgál:
⇒ΔCT = CT (célgén) – CT (endogén referenciagén)

ΔΔCT érték
A ΔΔCT érték egy érdeklődésre számot tartó minta (pl. stimulált sejtek) átlagos ΔΔCT értéke és egy referenciaminta (pl. nem stimulált sejtek) átlagos ΔΔCT értéke közötti különbséget írja le.A referenciamintát kalibrációs mintának is nevezik, és az összes többi mintát erre normalizálják a relatív mennyiségi meghatározáshoz:
⇒ΔΔCT = átlagos ΔCT (érdekes minta) – átlagos ΔCT (referenciaminta)

Endogén referenciagének (endogén referenciagének)
Az endogén referenciagének, például a háztartási gének (háztartási gének) expressziós szintjei nem térnek el a minták között.A referenciagén és a célgén CT-értékeinek összehasonlítása lehetővé teszi a célgén expressziós szintjének normalizálását a bemeneti RNS vagy cDNS mennyiségéhez (lásd a fenti ΔCT-értékekről szóló részt).

A belső referenciagének megfelelőeklehetséges RNS degradáció vagy enziminhibitorok jelenléte az RNS-mintákban, valamint az RNS-tartalom változásai, a reverz transzkripció hatékonysága, a nukleinsav-visszanyerés és a mintakezelés.Az optimális referenciagén(ek) kiválasztásához módosítottuk az algoritmust, hogy lehetővé tegyük az optimális referencia kiválasztását a kísérleti beállítástól függően.

Belső irányítás
Kontroll szekvencia, amely ugyanabban a reakcióban amplifikálódik, mint a célszekvencia, és egy másik szondával szondázzák (azaz duplex PCR végrehajtása).A belső kontrollokat gyakran használják a sikertelen erősítések kizárására, például amikor a célszekvencia nem észlelhető.
Kalibrációs minta
Referenciaminta (például egy sejtvonalból vagy szövetből származó tisztított RNS), amelyet a relatív mennyiségi meghatározás során használnak az összes többi minta összehasonlítására egy gén relatív expressziós szintjének meghatározásához.A kalibrációs minta bármilyen minta lehet, de általában kontroll (például kezeletlen minta vagy a kísérlet nulla időpontjából vett minta).

Pozitív vezérlők
használjon kontroll reakciókatismert mennyiségű sablon.Pozitív kontrollokat gyakran használnak annak ellenőrzésére, hogy egy primerkészlet vagy primer-szonda készlet megfelelően működik-e, és hogy a reakció megfelelően van-e beállítva.

Nincs sablonvezérlés (NTC)
Kontroll reakció, amely tartalmazza az amplifikációs reakció összes szükséges komponensét, kivéve a templátot, amelyet általában vízzel helyettesítenek.Az NTC használatával meg lehet találni a reagens szennyeződés vagy idegen DNS okozta szennyeződést, így biztosítva a kimutatási adatok hitelességét és megbízhatóságát.Az NTC kontroll erősítése szennyeződést jelez.

Nincs RT vezérlés (NRT)
Az RNS-kivonási folyamat tartalmazhat maradék genomiális DNS-t, ami rendkívül káros és az adatminőséget befolyásoló hibás és a qPCR természetes ellensége, ezért a kísérletek tervezésekor úgy kell kialakítani, hogy csak az RNS kimutatását erősítse.Két módja van, az egyik az intronok közötti primerek tervezése, a másik a DNS teljes eltávolítása, melyik a jobb, erről később lesz szó.Az NTR kontroll egy varázstükör a DNS-szennyezés kimutatására.Ha erősítés van, az azt jelenti, hogy szennyezés van.

Szabványok
A standardok ismert koncentrációjú vagy kópiaszámú minták, amelyeket standard görbe felépítésére használnak.A standard stabilitásának biztosítása érdekében a génfragmenst általában a plazmidba klónozzák, és standardként használják.

A standard görbe
általában legalább 5 koncentráció gradiensre hígítjuk a standard termékkel a duplázási aránynak megfelelően, és 5 pontot rajzolunk a CT-érték és a másolatszám koordinátáiba, és a pontokat összekötve egy vonalat képezünk egy standard görbét.Minden standard görbe érvényességét ellenőrizni kell.A meredekség értéke –3,3 és –3,8 közé esik, és minden koncentrációt három párhuzamosban hajtunk végre.A többi ponttól jelentősen eltérő pontokat el kell dobni.A vizsgálandó minta CT-értéke bekerül a standard görbébe, és kiszámítható a vizsgálandó minta expressziós szintje.

A vizsgálandó minta CT-értéke bekerül a standard görbébe, és kiszámítható a vizsgálandó minta kezdeti kópiaszáma.

Hatékonyság és lejtés
A standard görbe meredeksége a valós idejű PCR hatékonyságát mutatja.
·A -3,322-es meredekség azt jelzi, hogy a PCR-amplifikáció hatékonysága 1, vagyis 100%-os, és a PCR-termék mennyisége minden ciklusban megduplázódik.
·A –3,322-nél kisebb meredekség (pl. –3,8) a PCR hatékonyságát jelzi
·A –3,322-nél nagyobb meredekség (pl. –3,0) azt jelzi, hogy a PCR hatékonysága 100%-nál nagyobbnak tűnik, ami érdekes, hogy egy PCR-ciklus hogyan hozhatja létre az amplifikált termék több mint kétszeresét?Ez a helyzet a PCR-reakció nemlineáris fázisában fordul elő, vagyis nagymértékű nem specifikus amplifikáció történik.

olvadási görbe
A qPCR-amplifikáció befejezése után a PCR-terméket felmelegítjük.A hőmérséklet emelkedésével a kétszálú amplifikációs termék fokozatosan megolvad, ami a fluoreszcencia intenzitásának csökkenését eredményezi.Egy bizonyos hőmérséklet (Tm) elérésekor nagyszámú termék megolvad.A fluoreszcencia élesen csökken.A különböző PCR termékek eltérő Tm értékkel és eltérő olvadási hőmérséklettel rendelkeznek, így a PCR specificitása azonosítható.

Olvadási görbe (derivatív görbe)
Az olvadási görbe egy csúcstérképet képez, amely intuitívabban képes megjeleníteni a PCR termékfragmensek helyzetét.Mivel az olvadási hőmérséklet a DNS-fragmens Tm-értéke, néhány, a DNS-fragmens Tm-értékét befolyásoló paraméter megítélhető, mint például a fragmentum mérete, a GC-tartalom stb. Általánosságban elmondható, hogy a primer tervezési elveink szerintaz amplifikált termék hossza 80-300 bp tartományba esik, tehát az olvadáspontnak 80°C és 90°C között kell lennie.

Az olvadási görbe értelmezése: Ha az egyetlen fő csúcs 80°C-90°C között jelenik meg, az azt jelenti, hogy a fluoreszcens kvantitatív PCR tökéletes;ha a főcsúcs 80°C-90°C között jelenik meg, és az egyéb csúcsok 80°C alatt jelennek meg, akkor alapvetően a primer dimert tekintjük.Megoldása érdekében megpróbálhatja növelni az izzítási hőmérsékletet;ha a főcsúcs 80°C-90°C között jelenik meg, és az egyéb csúcs a hőmérséklet emelkedésével ismét megjelenik, akkor alapvetően DNS-szennyeződésről van szó, és a DNS-t a kísérlet kezdeti szakaszában el kell távolítani.

Természetesen továbbra is vannak abnormális helyzetek, amelyeket az alábbiakban egyenként részletezünk.
3. Fejlett tudás

A qPCR elvégzéséhez azt kell mondanom, hogy MIQE,Minimális információkiadásáraMennyiségiValós idejű PCRKísérletek – a minimális információ a valós idejű kvantitatív PCR-ről szóló cikkek közzétételéhezkísérletek.Annak érdekében, hogy mindenki megértse, leegyszerűsítjük a legfontosabb tartalmat.

A MIQE eredeti szövegében kereshetsz az interneten, és a legfontosabb, hogy kiköti aadatellenőrző lista, amelyet egy cikk közzétételekor meg kell adni .

A bírálók ezen részletek elolvasásával megítélhetik a kísérlet minőségét;a jövő olvasói ezt is felhasználhatják a kísérlet megismétlésére vagy javítására.
Érdemes megjegyezni, hogy ebben a listában az egyes listák fontosságát E vagy D jelöli.Mit jelent?E: lényeges információ (be kell nyújtani);D: kívánatos információ (a lehető legtöbbet adjon meg).

MIQE (1) – Kísérleti tervezés
Sok szemétláda, aki befejezte a védekezését az érettségi után, nem fogja tudni, hogyan kell önállóan kísérletet tervezni, kinyitni a füzetét, és azt tenni, amit a tanár mond neki.Emiatt a kísérleti tervezés nem volt szigorú, és a magazin szerkesztősége azt mondta, hogy ezt a képet és azt a képet akarták kitalálni, ezért kábultan csinálták.Így készülnek a szemétládák!

Az otthonhoz közelebb a kísérlet első elve az, hogy meghatározzuka kísérleti logika szigora.A legalapvetőbb a kísérleti tervezés, a kísérleti tervezésnél pedig az, hogy hogyan állítsuk be a célmintát, a referenciamintát (kontroll), és az ismétlések számát, hogy a kísérleti adatok referenciálisak, összehasonlíthatók és meggyőzőek legyenek.

A célmintaarra a mintára vonatkozik, amelynél egy bizonyos kezelés után meg kell határoznunk a célgént.A referencia mintaa kezelés nélküli minta, amelyet gyakran vad típusnak neveznek a biológiában.

Kísérleti ismétléseknagyon fontosak.Általában a meggyőző ismétlések számának többnek kell lennie háromnál.Meg kell különböztetni, hogy mi a biológiai és mi a technikai replikáció.

Biológiai replikációk: Ugyanaz az ellenőrző kísérlet különböző anyagokkal (idő, növények, tételek, reakciólemezek) végzett.

Biológiai megkettőzés
Vegyük például a paprika növényvédőszeres kezelését.Az ABC három növényére peszticideket akarunk permetezni, majd az ABC három növénye három biológiai ismétlés, és ugyanaz a különböző anyagokkal végzett ellenőrző kísérlet.De kísérletként mindenképpen szükség van egy kontrollra, így az A növény egyik ágát permetezhetjük, hogy az A növényből egy kísérleti csoportot alkothassunk, és nem permetezzük az A növény többi ágát, hogy kontrollcsoportot alkossunk.Csináld ugyanezt a B-vel és C-vel is.

Műszaki másolatok (műszaki másolatok): Ez egy megismételt kísérlet, amelynek célja a működés által okozott hibák elkerülése, ami valójában egy duplikált lyuk ugyanabban az anyagban.Mind a kezeléseknek, mind a kontrolloknak rendelkezniük kell a célgén és a belső referenciagén replikációs beállításával (minimum három).

Technikai ismétlés
Vegyük ismét példának a növényvédő szerrel kezelt paprikát.Az A növény kísérleti csoportjában három 1-es, 2-es és 3-as PCR-lyukat készítettünk a célgénjére, illetve a belső referenciagénre, hogy a kimutatás utáni átlagot vegyük.Az A növény elleni védekezésnél az A csoportokat is ugyanúgy kezelik.Hasonlóképpen végezze el a B és C növények kezelését.Ez technikai ismétlés.

Érdemes megjegyezni, hogyami bekerül a statisztikába, az a biológiai ismétlés, a technikai ismétlés pedig annak tesztelése, hogy a kísérleti folyamatban vannak-e véletlenszerű jelenségek, hogy a kísérleti eredményeket hitelessé tegyük, vagyis elkerüljük a hibákat azáltal, hogy átlagot vesszük, ahogy szoktuk mondani.

Negatív kontrollok – NTC és NRT
NTC (sablon nélküli vezérlés), egy sablon nélküli kontrollt használnak annak ellenőrzésére, hogy a kísérleti anyag szennyezett-e.Általában a vizet sablonként használják.Ha fluoreszcens reakció van, az azt jelzi, hogy nukleinsav-szennyeződés történt a laboratóriumban.

Ezek a szennyezések a következőkből származnak: szennyezett víz, nem minősített, endogén DNS-t tartalmazó reagensek, primer szennyezés, laboratóriumi berendezések szennyezése, aeroszolszennyezés stb., RNáz megkötőket és RNáz inhibitorokat kell használni.Az aeroszolos szennyezést a legnehezebb megtalálni.Képzelje el, hogy a laboratóriuma olyan, mint a szmog, különféle nukleinsavak szuszpendálva a levegőben.

NRT (No-Reverse Transcriptase), a reverz transzkripció nélküli kontroll, a nem reverz transzkripciós RNS negatív kontrollként, amely a gDNS-maradék kontrollja.

Génexpresszió során az RNS mennyiségét a reverz transzkripció utáni cDNS mennyiségének kimutatásával detektáljuk.Ha az RNS tisztítása során gDNS maradvány található, az hibákat okoz a kísérleti eredményekben, mivel a tényleges eredmények gDNS és cDNS.Az aggregált szinten, nem csak a cDNS-en, a gDNS-t teljesen el kell távolítani az RNS-kivonás során.

MIQE (2) – mintainformáció
Az úgynevezett mintainformációk azt jelentik, hogy amikor a qPCR-ről cikket publikálunk, a mintainformációkat egyértelműen el kell magyaráznunk, ami a cikk elengedhetetlen része.Hasonlóképpen, amikor mintákat dolgozunk fel, saját műveleteinket is szabályoznunk kell, hogy biztosítsuk a minták érvényességét.

A minta leírása csak eredmény, a teljes kísérlet során felvett anyagokra érdemes jobban odafigyelni.

Kísérleti anyagok kiválasztása
Vérminták – válasszon friss vért, legfeljebb 4 órát.Sejtminták – válasszon friss sejteket az erőteljes növekedés időszakában.Állati szövet – Válasszon friss, erőteljesen növekvő szövetet.Növényi szövet – Válasszon friss, fiatal szövetet.

Biztosan észrevetted, hogy ebben a néhány mondatban van egy kulcsszó: friss .
A fenti mintákhoz a legjobb, költséghatékony és stabil készlet a piacon a Foregene készlete, amely gyorsan és egyszerűen tudja kinyerni DNS-üket és RNS-üket.

Vér DNS minikészlet

Cell Total RNS Isolation Kit

Animal Total RNS Isolation Kit

Plant Total RNS Isolation Kit

Plant Total RNS Isolation Kit Plus

Növényi DNS izolációs készlet

Kísérleti anyagok tárolása
Általánosságban elmondható, hogy nem javasoljuk a minták tárolását, ha a körülmények megengedik.Vannak azonban olyan barátok, akik nem tudnak azonnal kísérleteket végezni a mintavétel után, sőt van, aki folyékony nitrogénes tartályokat is ki kell vinnie a terepre mintavétel céljából.

Az ilyen szorgalmas barátoknak csak azt tudom mondani, hogy nem értenek a reagens fogyóeszközökhöz.Manapság sok reagensfogyasztó cég gyárt olyan reagenseket, amelyek képesek RNS-mintákat szobahőmérsékleten tárolni, és Ön választhatja ezek használatát.A hagyományos tárolási mód a folyékony nitrogén tárolása, kisméretű, könnyen szállítható folyékony nitrogén tartály használatával.Miután visszavitte a mintát a laboratóriumba, tárolja -80°C-os hűtőszekrényben.

Az RNS-t tartalmazó kísérleteknél a hatszavas elvet kell követni:alacsony hőmérséklet, enzimmentes,ésgyors .

Az alacsony hőmérséklet fogalma könnyen érthető;enzimek nélkül az RNáz mindenütt jelen van a világon, ahol élünk (különben megölte volna a HIV), ezért nagyon fontos fogalom, hogyan kerüljük el az RNázt a kísérletek során;gyors,Nincs a világon Kung Fu, amit ne lehetne megtörni, csak a sebességet ne lehetne megtörni.

Ezért bizonyos értelemben minél rövidebb az extrakciós idő, annál jobb a készlet.MiértForegene's kit hangsúlyozzák a sebességet, mert jól ismerik.

PS: Egyes lányok nagyon körültekintően végeznek kísérleteket, de ezek nem olyan jók, mint egy slam dunk több év munka után.Úgy érzik, hogy Isten igazságtalan, panaszkodik másokról, és életet keres.Valójában nem értette.Nem védte jól az RNS-t, a slam dunk játékos pedig ügyes volt.Amikor a kísérletet végezte, úgy gondolta, hogy háromszor, ötször és két osztással fejezi be a slam dunk-ot, de a kísérletet jól csinálta.

jegyzet: Lassabb, nagyobb az RNáz invázió esélye.Hogyan képezd magad gyorsnak?Nincs mód, csak gyakorolj többet.

Különböző kísérletekhez és különböző mintákhoz továbbra is több szakirodalmat kell elolvasni, és megfelelő feldolgozási módszert választani.A mintagyűjtés és -tárolás folyamatához a MIQE megköveteli, hogy ezt egyértelműen be kell írni a dolgozatba, hogy a lektorok áttekinthessék a dolgozat megbízhatóságát, és a döbbent fiatalok számára is kényelmes legyen a kísérlet megismétlése.

Bár a biológiai kísérletek bonyolultak, csúcsminőségűek.Ha nem vigyázol, felboríthatod a világot.Például a SARS-t biokémiai válsággá tenni, vagy hibrid rizst készíteni 1,3 milliárd ember megmentésére.Az alábbi kép egy kémiai kísérlet, már csak a farkaszerű megjelenéséből is meg kell értenie, mennyire büszke a kutatására.Felejtsd el, ne feketítsd el.

MIQE (3) – nukleinsav extrakció.
A nukleinsav-kivonás nagy esemény, és minden molekuláris biológiai kísérlet a nukleinsav-kivonással kezdődik.Először is másoljuk le a MIQE tartalmát a nukleinsav-kivonásról.

Ezt a formát nézve nem maradhatsz a felszínen.A forma egy dogma.Ahhoz, hogy kiváló tanuló legyél, meg kell kérdezned, hogy miért.Ennek a táblázatnak a lényeges tartalma: Folytatásaz RNS tisztasága, integritása, konzisztenciája és extrakciós mennyisége .

Az első része afolyamat vagy eszköz a nukleinsav extrakciós lépése.Ha automata nukleinsav extraktort használ az extrakcióhoz (speciális, vásárláshoz forduljon hozzám), meg kell adnia a műszer típusnevét.

A készlet neve és

milyen készletet használtak a változtatás részleteihez, milyen speciális reagenseket adtak hozzá, vagy milyen speciális műveleteket hajtottak végre, világosan el kell magyarázni, hogy mások könnyen megismételhessék a kísérletet.

Vannak, akik speciális minták kinyerésekor speciális reagenseket adnak hozzá, azt gondolva, hogy ez az ő titkos fegyverük, és nem mondják el másoknak.Miközben titkolják, elveszítik annak lehetőségét is, hogy a cikkét ragyogóvá tegye.Ne legyél okos, őszintébbnek kell lenned, mint a vidéki öreg Zhang a tudományos kutatásban, ha okos akarsz lenni, akkor hülyét csinál a cikk.

emlékeznie kell a készlet termékszámáraamikor megrendeli a készletet és megírja a cikket .Általában két szám található a készleten: Cat – katalógusszám (termékszám, cikkszám), tétel – termék tételszám (a termék gyártási tételének jelzésére szolgál).

Ráadásul a CAS számot gyakran használják biokémiai reagensek rendelésénél, és ezt együtt népszerűsítem.A CAS-szám az a szám, amelyet az American Chemical Society ad minden egyes új kémiai gyógyszernek.Általában három számot kötőjel köt össze.Rushui CAS-száma: 7732-18-5.A vegyi anyagoknak gyakran több álneve is van, de a CAS-szám egyedi.A gyógyszer rendelésekor először ellenőrizheti annak CAS-számát.

Az otthonunkhoz közelebb, miért kell ezeket a dolgokat világosan leírnunk?Valójában az is, hogy ellenőrizze az RNS-kivonás minőségét.A műszerek és készletek használata következetesebbé teszi az RNS-kivonást.A közönséges laboratóriumok extrakciós léptéke nem nagy, és készletekkel beszerezhető.

A DNáz vagy RNáz kezelés részletei
A fluoreszcens kvantitatív PCR fontos kérdése a DNS-szennyeződés megelőzése, és ne kísérletezzen, ha szennyeződés van.Ezért feltétlenül közölni kell a DNS feldolgozásához használt eljárást annak bizonyítása érdekében, hogy a kísérleti folyamatban lévő DNS-t teljesen és teljesen eltávolították.sematikus diagrammal ábrázolva.

Az RNS és a DNS sematikus diagramja
Általában a DNS eltávolításának módja az, hogy az RNS-t extrakció után DNázzal kezelik.Ezek azonban viszonylag régi módszerek.A kereskedelemben kapható RNS extrakciós készletek képesek voltak eltávolítani a DNS-t az extrakciós folyamat során DNáz hozzáadása nélkül.Például a Foregene készleteinek sorozata.

jegyzet: A DNS eltávolítása az RNS extrakció során nagyon veszélyes kétélű kard, amely meghosszabbítja az RNS extrakció működési idejét és növeli az RNS lebomlásának kockázatát.Alapvetően ez egy kompromisszum az RNS-hozam és a tisztaság között.

Ráadásul a szilícium-dioxid alapú adszorpciós oszlophoz nagyon kicsi a hozzáadott DNáz mennyisége, és a hatás eléréséhez jó minőségű DNázt kell használni.A nem optimalizált DNS-t nem lehet gyorsan és teljesen megemészteni.Ez a kereskedő technikai színvonalának tesztje.Persze vannak még furcsább kereskedők, akik azzal kérkednek, hogy a DNS DNáz nélkül is eltávolítható.Azt lehet mondani, hogy aki azzal kérkedik, hogy a DNS teljesen eltávolítható DNáz nélkül, az huligán.A DNS egy viszonylag stabil, kétszálú szerkezet, és nem lehet pusztán beszéddel és nevetéssel kiirtani.

Szennyezettségértékelés
értékelési módszer: elektroforézis detektálás, 1% agaróz, 6V/cm, 15 perc, töltés 1-3 ul

Nukleinsav kvantitatív elemzés
általában UV spektrofotométerrel mérik.Először hadd népszerűsítsem az OD260, OD280 és OD230 három érték jelentését.
·OD260nm: Ez a nukleinsav legmagasabb abszorpciós csúcsának abszorpciós hullámhossza, és a legjobb mért érték 0,1 és 1,0 között van.Ha nem, hígítsa vagy koncentrálja a mintát, hogy a tartományon belül legyen.
·OD280nm: A fehérje és fenolos anyagok legmagasabb abszorpciós csúcsának abszorpciós hullámhossza.
·OD230nm: A szénhidrátok legmagasabb abszorpciós csúcsának abszorpciós hullámhossza.

Ezután beszéljünk az egyes mutatók szerepéről.Az A260 esetében a nukleinsav hozamának mérésére használható.Ha OD260=1, dsDNS=50μg/ml, ssDNS=37μg/ml, RNS=40μg/ml.

A tisztaság érdekében meg kell vizsgálnunk a gyakran tapasztalt arányokat: OD260/280 és OD260/230.
·Tiszta DNS: OD260/280 körülbelül 1,8.Ha nagyobb, mint 1,9, az RNS-szennyezést jelez, ha pedig kisebb, mint 1,6, akkor fehérje- és fenolszennyezést.
·Tiszta RNS: 1.7
·OD260/230: Legyen szó DNS-ről vagy RNS-ről, a referenciaérték 2,5.Ha kisebb, mint 2,0, az cukor-, só- és szervesanyag-szennyeződést jelez.

RNS integritás

Nagyon fontos az RNS integritásának mérése.Általában egy RNS-denaturációs gél kísérletet kell végezni annak ellenőrzésére, hogy a 28S és 18S RNS közötti fényesség kettős összefüggés-e.Amikor megjelenik a harmadik 5S sáv, az azt jelenti, hogy az RNS lebomlani kezdett, kivéve a gerincteleneket.

Adatok az RNS minőségértékeléséhez: A fenti teszteken kívül az RNS integritás szempontjából fejlettebb műszeres tesztek is léteznek, ilyen például az Experion automata elektroforézis rendszer RQI integritástesztje, amely képes kimutatni, hogy az RNS nem degradálódik-e láthatatlanul.

A tudományos kutatásban a fluoreszcens kvantitatív PCR a célgén és a belső referenciagén összehasonlítása.Ezért az RNS-minta megőrzése, az RNS extrakció stb. folyamatában az elsődleges cél az RNS integritásának biztosítása.

Az alábbi ábrán könnyen megérthetjük, hogy az RNS integritása hogyan befolyásolja a célgén és a belső referenciagén közötti egyensúlyt.A degradáció a gén hiányossá válásához vezet, legyen szó a belső referenciagén hiányosságáról vagy a célgén hiányosságáról, nagy hatással lesz az adatokra.

A célgén és a referenciagén sematikus diagramja nem lehet igaz

Gátlási teszt (a CT-érték elnyomott-e magas vagy alacsony koncentrációban vagy egyéb körülmények között)

Ha ezt az ábrát vesszük példaként, az öt görbe Ct értékei a következők.A CT-értékek görbék közötti eloszlása ​​egyenetlen, a Ct-értékek késleltetést mutatnak magas és alacsony koncentrációknál, ami a PCR-gátlás esete.

Kulcspont: Az RNS-kinyerés folyamatában fel kell hagynunk a tévhitekkel, és helyeseket kell kialakítanunk.

A rossz ötlet az, hogy az RNS-kivonás csak a hozamot követi, azt gondolva, hogy minél nagyobb mennyiségű RNS-t nyerünk, annál jobb.Valójában, amikor kvantifikációt végzünk, ha a gének száma nem túl nagy, nincs szükségünk sok RNS-re.A kivont RNS mennyisége több mint elegendő.

A helyes koncepció a következő:Az RNS-kivonásnak törekednie kell a tisztaságra, integritásra és konzisztenciára.A tisztaság biztosíthatja, hogy a későbbi reverz transzkripciót ne gátolja, és az adatokat ne befolyásolja a DNS.Az integritás biztosítja a célszekvenciák és a belső hivatkozások egyensúlyát.A konzisztencia biztosítja a stabil mintabetöltést.

MIQE (4) – fordított transzkripció
Tévhit: a nagyobb mintamennyiségre való törekvés.
Helyes koncepció: Törekedjen a konzisztenciára (stabilitásra), függetlenül a betöltött RNS mennyiségétől, a reverz transzkripció hatékonysága konzisztens marad, biztosítva, hogy a cDNS-beli különbségek valóban tükrözzék az mRNS különbségeit.
Ezt a folyamatot egy sematikus diagrammal magyarázzuk:

A fordított transzkripció hatékonyságának sematikus diagramja nem igaz
Először is meg kell értenünk a különbséget a reverz transzkripciós folyamat és a PCR folyamat között.A PCR többszörös melegítési és annealing folyamaton megy keresztül, és a célfragmens exponenciálisan növekszik;míg a fordított transzkripció nem rendelkezik ezzel a folyamattal, elképzelhetjük, hogy a reverz transzkripció valójában egy az egyhez A replikációs folyamat során annyi RNS-darab

ahány cDNS-információt lehet kapni, azt mára meg kell érteni, mert a nagy és kicsi töredékek reverz átírása megtörtént, és nem lehet egyetlen fragmentumra fókuszálni.És mivel az RNS mennyisége viszonylag kicsi, a kapott cDNS mennyisége is viszonylag kicsi, ellentétben a PCR-rel, amely amplifikációs hatással bír, így alapvetően lehetetlen kimutatni.

cDNS elektroforézis eredményei
Másodszor, ideális esetben a reverz transzkripciót egy az egyhez hajtják végre, de egyetlen cég reverz transzkriptáza sem tudja elérni ezt a hatást.Alapvetően a legtöbb reverz transzkriptáz hatékonysága 30-50% között mozog.Ha ez a helyzet, akkor inkább egy viszonylag stabil reverz transzkripciós hatékonyságot szeretnénk, amit az ábrán szeretnénk látni: 3 RNS 2 cDNS-t, 6 RNS 4 cDNS-t kap, tehát függetlenül attól, hogy mennyi mintát töltünk be, a reverz transzkripció hatékonysága viszonylag stabil.Nem akarunk olyan helyzetet látni, amikor a reverz transzkripció hatékonysága instabil, és a magas koncentráció gátolt.

Tehát hogyan ellenőrizhető, hogy a fordított transzkripció hatékonysága stabil-e?A módszer nagyon egyszerű, csak egy összehasonlító tesztet kell elvégezni: az egyik az RNS kétszeres hígítása után cDNS-vé történő fordított átírás, a másik pedig az, hogy a fordított átírás után cDNS-re duplázó hígítást készítünk, majd végezzünk qPCR-t, hogy lássuk a kapott meredekséget.Kiváló tanulóként másodpercek alatt meg kell értenie.Az alábbiak szerint:

Az RNS és a cDNS hígítása annak tesztelésére, hogy a reverz transzkripció hatékonysága stabil-e
Reverz transzkriptáz és kit
Hogyan lehet tökéletes fluoreszcens kvantitatív PCR kiváló reverz transzkriptázzal és kittel?A reverz transzkriptáz forrás szerint nagyjából két típusra osztható, az AMV illM-MLV, és teljesítményük megegyezik a táblázatban láthatóval.

RNáz H aktivitás
Az RNáz H ribonukleáz H, a kínai neve ribonukleáz H, amely egy endoribonukleáz, amely specifikusan képes hidrolizálni az RNS-t a DNS-RNS hibrid láncban.Az RNáz H nem tudja hidrolizálni az egyszálú vagy kétszálú DNS-ben vagy RNS-ben lévő foszfodiészter kötéseket, azaz nem képes megemészteni az egyszálú vagy kétszálú DNS-t vagy RNS-t.Általában a cDNS második szálának szintézisében használják.

Ez egy furcsa dolog.Azt mondjuk, hogy a reverz transzkriptáz RNáz H aktivitással rendelkezik, nem azt, hogy a reverz transzkriptáz RNáz H-t tartalmaz, és előfordulhat, hogy nem lehet elkülöníteni az RNáz H-t a reverz transzkriptáztól, talán bizonyos csoportok konformációja miatt a reverz transzkriptázban Ezt az aktivitást a reverz transzkriptáz okozza.

Ezért az AMV magasabb reverz transzkripciós hatékonyságától függetlenül az RNáz H aktivitása csökkenti a cDNS hozamát.Természetesen a reagensgyártók folyamatosan optimalizálják termékeiket, hogy a lehető legnagyobb mértékben kiküszöböljék az RNáz H aktivitást a reverz transzkriptázban, hogy növeljék a cDNS hozamát.
Izzítási hőmérséklet

Az RNS másodlagos szerkezete különböző hőmérsékleteken
Lásd a fenti ábrát az RNS másodlagos szerkezetére különböző hőmérsékleteken, és használja az mFold online eszközt a célfragmens másodlagos szerkezetének meghatározására meghatározott hőmérsékleti és sókoncentrációs feltételek mellett.55°C-on az RNS másodlagos szerkezete még nagyon összetett, a reverz transzkriptáz nem tud működni, és a másodlagos szerkezet sem oldódik fel teljesen 65°C-ig, miközben az AMV és az M-MLV optimális hőmérséklete jóval alacsonyabb ennél a hőmérsékletnél.
mit kell tenni?A másodlagos struktúra magának a templátnak a komplementer párosítása, ami erős versenyhez vezet a primer és a reverz transzkriptáz, valamint a templát között, ami egy sor olyan problémát eredményez, mint például az alacsony E és rossz ismételhetőség.

mit kell tenni?Csak a lehető legnagyobb mértékben növelje az izzítási hőmérsékletet.

Sok reagensgyártó géntechnológiával javítja reverz transzkriptázát.Néhányan növelik a reakcióhőmérsékletet, például Jifan és Aidelai, mások pedig eltávolítják az RNáz H enzim aktív csoportját, hogy javítsák az enzim és az RNS-templát közötti affinitást.A nagy affinitás versenyképesen kipréseli a másodlagos struktúrát és zökkenőmentesen olvassa be, valamint nagymértékben javítja a reverz transzkripció hatékonyságát.
Kulcsfontosságú szempont: A reverz transzkripció fontosabb a reverz transzkripció hatékonyságának konzisztenciájának elérése érdekében (az enzimeknek nemcsak hatékonynak, hanem stabilnak is kell lenniük), nem pedig a betöltött minta mennyisége, ha nem egy különösen nagy léptékű fluoreszcens kvantitatív PCR, akkor egyáltalán nem lesz lehetséges.Több cDNS.
Különböző gyártók is tettek némi erőfeszítést a következetesség érdekében.Például a legtöbb cég most már szabványos készletként csomagolta a fordított átírást, ami jó választás.
Például a Foregene RT Easy Series készletei:

RT Easy I (Master premix az első szál cDNS szintézis készlethez)

MIQE (5) – célgén információ

A fenti ábra megmagyarázza
1. Az, hogy ez a gén hatékony-e ismételt kísérletekben, általában ismételt kísérletekkel ellenőrizhető.
2. Génazonosító, tudod.
3. A gén hossza, a célgén teljes hossza biztosan nem probléma.A primerek tervezésekor ügyeljen arra, hogy az amplikon hossza 80-200 bp között legyen a jobb amplifikációs hatékonyság érdekében.
4. Sequence Blast összehasonlító információ, a célgént össze kell hasonlítani a génbankban, hogy megakadályozzuk a nem specifikus amplifikációt.
5. Pszeudogének jelenléte.A pszeudogén egy normál génhez hasonló DNS-szekvencia, de elveszti normális funkcióját.Gyakran előfordul az eukarióták több génből álló családjában.Általában ψ-vel jelöljük.Ez egy nem működő genomiális DNS-másolat a genomban, amely nagyon hasonlít a kódoló génszekvenciához., általában nem íródnak át, és nincs egyértelmű fiziológiai jelentésük.
6. A primerek elhelyezkedése az exonokhoz és intronokhoz viszonyítva.A kezdeti években, amikor megoldottuk a DNS-szennyeződés problémáját, gyakran figyeltünk a primerek, exonok és intronok helyzetére, és általában fontolóra vettük az intronok közötti primerek tervezését, hogy elkerüljük a DNS-amplifikációt.Lásd az alábbi ábrát: a fekete az intronokat, a különböző kékek az exonokat, a rózsaszín a gyakori primereket, az élénkpiros pedig az intronokat átívelő primereket.

Sematikus, soha nem igaz
Milyen tökéletes tervnek tűnik ez, de valójában a legtöbb esetben a transz-intron primerek nem olyan varázslatosak, mint képzeljük, és nem specifikus erősítést is okoznak.Tehát a DNS-szennyeződés megelőzésének legjobb módja a DNS teljes eltávolítása.
7. Konformáció előrejelzése.Ezzel a példával ismételten használja az mFold online eszközt a célfragmens másodlagos szerkezetének meghatározásához egy adott hőmérsékleten és sókoncentráción.

Az RNS másodlagos szerkezete különböző hőmérsékleteken
A másodlagos struktúra magának a templátnak a komplementer párosítása, ami erős versenyhez vezet a primer és a templát párosítás között, és kisebb az esélye a primer kötődésének, ami egy sor olyan problémát eredményez, mint például az alacsony E és a rossz ismételhetőség.A szoftveres előrejelzésen keresztül, ha nincs másodlagos szerkezeti probléma, az nagyszerű lenne.Ha van, a következő cikkünkben konkrétan megvitatjuk a probléma megoldását.

MIQE (6) – qPCR oligonukleotidok

A fluoreszcens kvantitatív PCR esetében az első dolog, amellyel minden nap küzd, az RNS extrakció, a második pedig a primer tervezése.
Mindenekelőtt továbbra is ellenőrizzük a MIQE ellenőrzőlista alapján az alapozó tervezésére vonatkozó szabályokat.Annyira egyszerű, hogy a szemétládák nevetni tudnak, és egy mondattal be is fejezhetjük: derítsük ki a primer szonda sorrendjét, helyzetét és a módosítási módot.A primer tisztítási módszernél a primer szintézis jelenleg olyan olcsó, a qPCR méltó a PAGE és az azt meghaladó tisztítási módszerekhez, és a szintézis eszköz információi nem fontosak.Sokan évtizedek óta csinálnak primereket, és nem tudják, hogy a szintetizátor ABI3900.
Ami az alapozótervezés alapelveit illeti, ezeket nem kell fejből megjegyezni, mert a legtöbb alapozó tervező szoftver vagy online eszköz megoldja ezeket a problémákat (ajánlott online eszköz primer3.ut.ee/), és az alapozótervezés 99,999%-a nem manuálisan történik. Nézd, a szerző néha több száz primert tervez naponta, ha egyenként átolvasod, akkor egyenként átolvasod.
Csak ellenőrizze a következő pontokat az alapozók tervezése után:
1. A 3′-véghez közeli primerek tervezése: Ha a cDNS első szálú szintéziséhez oligo dT primereket használunk, figyelembe véve a reverz transzkripció hatékonyságát és az RNS integritását, a tervezett primereket a 3′ véghez közel kell megtervezni az amplifikációs hatékonyság javítása érdekében.Egy kép segítségével magyarázza el az alábbiakat (ezt nem lehet megérteni):

Miért kell az alapozókat a 3′ véghez közel tervezni, ez nem lehet igaz
2. TM érték: A Tm érték 55-65°C (mivel az exonukleáz aktivitás 60°C-on a legmagasabb), a GC tartalom 40%-60%.
3. BLAST: A genom nem specifikus amplifikációjának elkerülése érdekében Blast-ot kell használni a kiegészítő ellenőrzéshez.

MIQE(7) – qPCR folyamat

1. qPCR készlet
A MIQE követelményei szerint a cikkben egyértelműen le kell írni a teljes reakciókörülményeket, beleértve a PCR reakciórendszer konfigurációját, milyen kit használunk, ki a gyártó, mekkora a reakciórendszer, festékmódszert vagy szonda módszert alkalmazunk, PCR program beállításait.A veterán sofőrök minden bizonnyal azt fogják tapasztalni, hogy mindaddig, amíg a készletet kiválasztják, a fenti információk alapvetően meghatározottak.
Jelenleg a fluoreszcens kvantitatív PCR-készletek gyártása és gyártása nagyon kiforrott technológia.Amíg nem extrém rossz gyártókat választasz, nem nagy a valószínűsége a problémáknak, de azért szeretnénk megosztani veletek néhány pontot:
Hot-start Taq enzim:A PCR legfontosabb része a hot-start Taq enzim.A forgalomban lévő hot-start enzimeket általában két típusra osztják, az egyik egy kémiailag módosított hot-start enzim (ezt el lehet képzelni paraffin beágyazásként), a másik pedig egy melegindító enzim az antitestek módosítására (antigén-antitest kötés).A kémiai módosítás az enzimek melegindításának korai módja.Egy bizonyos hőmérséklet elérésekor az enzim felszabadítja aktivitását.Az antitesttel módosított hot-start enzim biológiai módszereket alkalmaz az enzim aktivitásának blokkolására.Egy bizonyos hőmérséklet elérésekor az antitest denaturálódik és fehérjeként inaktiválódik, és működésbe lép az enzimaktivitás.

Azonban mi haszna ennek?Ez a helyzet, az antitesttel módosított enzimek felszabadulási aktivitása gyorsabb, mint a kémiailag módosított enzimeké, így érzékenység szempontjából az ellenanyag-módosított enzimek enyhe előnyben vannak, így alapvetően nincs kémiailag módosított enzim a piacon lévő kitekben.Ha van, akkor ennek a gyártónak a technológiája még mindig az ezredforduló korszakában rekedt.
Magnézium ion koncentráció:A magnéziumion koncentrációja nagyon fontos a PCR reakcióban.A megfelelő magnézium-ion koncentráció elősegítheti a Taq enzimaktivitás felszabadulását.Ha a koncentráció túl alacsony, az enzimaktivitás jelentősen csökken;ha a koncentráció túl magas, az enzim által katalizált nem specifikus amplifikáció fokozódik.A magnéziumionok koncentrációja befolyásolja a primerek összekapcsolódását, a templát és a PCR-termékek olvadási hőmérsékletét is, ezáltal befolyásolja az amplifikált fragmensek hozamát.A magnéziumionok koncentrációját általában 25 mM-ra szabályozzuk.Természetesen egy jó készlethez a magnéziumionok koncentrációját jól szabályozni kell.Egyes kereskedők magnézium-ion-kelátképző szert adnak a reagenshez, ami a magnézium-ion-koncentráció automatikus beállításának hatását érheti el.
Fluoreszcens festék koncentráció:A fluoreszcens festék, ami az általunk általában használt SYBR Green, főként a kétszálú DNS kisebb barázdájához kötődve generál fluoreszcenciát, mivel a festék kétszálú DNS-hez való kötődése nem specifikus, vagyis Amíg a kettős szálú DNS kombinálódik vele, addig előfordulhat fluoreszcencia, így a DNS-háttérben template-dimerek képződnek a rendszerben.
PS: Fényérzékeny tulajdonságai miatt a piacon lévő termékeket általában barna, átlátszatlan centrifugacsövekbe csomagolják (az alábbi képen látható módon).Ez azonban problémába ütközik.Nehéz megállapítani, hogy a mintavételkor beszívták-e a folyadékot.Ebből a szempontból valóban a Qingke a legfelhasználóbarátabb (ahogy az alábbi képen is látható), az átlátszó tubus pedig egy átlátszatlan bádogzacskóba van csomagolva.Ezután tegye egy bádogzacskóba, figyelembe véve a fény és a mintavétel elkerülésének kényelmét.Ki kell választani a megfelelő termékszámot.A TSE204 egy szuper költséghatékony létezés, ami miatt szeretnék füvet ültetni.

A fluoreszcens festék koncentrációja is nagyon fontos.Ha a koncentráció túl alacsony, az amplifikációs görbe a későbbi szakaszban nem megy felfelé, és nem tökéletes;ha a koncentráció túl magas, az zavart okoz.Mivel a fluoreszcens kvantitatív PCR főként a CT-értéktől függ, ha a fluoreszcens festék koncentrációja nincs megfelelően beállítva, a mélypont jobb, mint a csúcspont.Természetesen a megfelelő festékkoncentráció a legjobb.

ROX: A ROX színezékeket a fluoreszcenciajel hibák kijavítására használják.Egyes műszergyártók kalibrálást igényelnek, míg mások nem.Például a Thermo Fisher Scientific valós idejű PCR-erősítő műszerének használata általában kalibrálást igényel, beleértve a 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus stb. eszközöket. A készlet általános utasításai leírják.
A Foregene qPCR Mix ROX festéket is tartalmaz, amely kényelmesen használható különféle modellekben.

Real Time PCR Kit-Taqman

Gyenge hidrogénkötés kezelése: A gyenge hidrogénkötések kezelése viszonylag technikai kérdés.Sok készlet kézikönyvét senki sem olvasta, de egyikük sem említette ezt a témát.Valójában ez olyan fontos.A bázisok kombinációja elsősorban a hidrogénkötések erősségétől függ.Az erős hidrogénkötések normál amplifikációt jelentenek, a gyenge hidrogénkötések pedig nem specifikus amplifikációhoz vezetnek.Ha a gyenge hidrogénkötéseket nem lehet jól kiküszöbölni, nem kerülhető el a nem specifikus amplifikáció.A szerző keretein belül csak néhány cég vette észre ezt a problémát.A készlet megvásárlásakor hivatkozhat arra, hogy gondolt-e erre a megoldásra a választani kívánt készlet esetében.

Reakció térfogata: A 20-50ul rendszert gyakrabban használják, és a kisebb mennyiségek valószínűleg hibákat okoznak.Általánosságban elmondható, hogy a kit utasításai a PCR reakciótérfogatok használatát javasolják.Ne legyen okos, és a költségek megtakarítása érdekében használjon kisebb mennyiségeket.a cél.A kereskedők által ajánlott mennyiséget valóban tesztelték, és előfordulhat, hogy nem tudják megoldani a kis mennyiségek okozta hibák problémáját.
2. A csőlemez gyártója és cikkszáma
Mindenki ismeri a fluoreszcens kvantitatív PCR elvét.A fluoreszcencia gyűjtése elsősorban PCR csőkupakokon keresztül történik.A PCR fogyóeszközök kiválasztásakor két szempontra kell ügyelni: jó fényáteresztésre és a műszerhez való megfelelőségre.Általánosságban elmondható, hogy a mainstream márkák táblái és csövei rendben vannak, de az adaptációt illetően alaposan kell választani, különben nem fogja tudni használni a hangszert.

4. Felső szintű tudás

MIQE (8) – qPCR validálás
Ez a qPCR legfontosabb prioritása!Annyi hős esett itt a homokba.Persze az is lehet, hogy szerencséd van, és a vizsgált gének egyszerűek, így a jégbarlangon keresztül lebegtél a szél mentén.A qPCR ellenőrző információi az adatok megbízhatóságának tesztelésére szolgálnak.A szükséges ellenőrzési információkat az alábbiak szerint soroljuk fel:

1. Specifikussági vizsgálat
A célgén-amplifikáció specificitását úgy teszteljük, hogy ellenőrizzük, hogy az elektroforézis kép egyetlen sáv-e;szekvencia ellenőrzése;olvadási görbe, hogy megnézzük, hogy a csúcstérkép egyetlen;enzimes emésztés ellenőrzése és egyéb módszerek.
Itt a ta nem specifikus amplifikáció elemzése olvadási görbék módszerével.Általánosságban elmondható, hogy amikor primereket tervezünk, a termékfragmens méretének 80-200 bp tartományban kell lennie, ami a PCR termék olvadási hőmérsékletét 80-85 °C tartományba teszi.Ezért, ha vannak különféle csúcsok, akkor más, nem specifikus amplifikációs termékeknek is kell lenniük;ha a csúcs 80 °C alatt jelenik meg, általában primer dimernek tekintik;ha a csúcs 85°C felett jelenik meg, akkor azt általában DNS-szennyeződésnek vagy nagyobb fragmentumok nem specifikus amplifikációjának tekintik.
Megjegyzés: Néha csak egyetlen csúcs van 80°C-on.Jelenleg ehhez a koncepcióhoz kell ragaszkodni.Valószínű, hogy az amplifikációs eredmények mindegyike primer dimer.

Normál olvadási görbe (egyetlen csúcs nem specifikus erősítés nélkül)

Problémás olvadási görbe (hamis csúcsok nem specifikus amplifikációja)
【Esetelemzés】

Van egy főcsúcs, de a primer dimer komoly
Az alábbi ábrán látható egycsúcsos olvadási görbe könnyen megtévesztheti a szemét, azt gondolva, hogy ez egy tökéletes kísérlet, de az eredmény teljesen rossz.Ilyenkor az olvadási hőmérsékletet kell néznünk.A csúcshőmérséklet 80°C alatt van, ami teljesen primer-dimer.

Nincs célfragmens, minden primer dimer
Itt a bátyám nem tudja abbahagyni.Az alábbi képen egy mobiltelefonnal készült fotó, amit egy szemétláda küldött nekem.Az általa használt reagensek mind általánosan használt márkák az iparban.Egyik T-előtag márkáról egy másik T-előtag márkára vált.Szerintem már kitaláltad.A szemétláda hozzám sírt: „Az első képen használt reagens túl jó, a csúcs pedig egyetlen.Később, az Ön által ajánlott reagens használata után olyan lesz, mint a második képen, vegyes csúcsokkal.Nyomorúságossá tettél."
Válasszuk szét a két grafikont.Első pillantásra az egyiknek egyetlen, a másiknak kettős csúcsa van.Hülyeség, egyetlen csúcs természetesen jó.Igaz ez?
Rosszabb, mint a Dou E, ha az alábbi képbe felteszem a két képet, azonnal megérted.Valójában könnyen megbénulunk egy ilyen képtől.Gondos elemzés után azt találtuk, hogy: az első ábra csúcsa 75°C-on van, ami teljesen primer dimer;a második ábra csúcsa 75°C-on és 82°C-on jelenik meg, legalábbis vannak A termék megjelenik.

Képek a tanulók visszajelzéseiről
Az alapvető probléma tehát nem a reagensek, hanem a primer tervezés problémája.Ugyanakkor ez azt is bizonyítja, hogy egyes nagy márkák nem vasminőségűek, és azt is bizonyítja, amit a bátyám korábban mondott: Nem a reagens márka támogatja a cikkedet.Ez az Ön cikke, amely a reagensek márkáját támasztotta alá.Képzeld csak el, ha a szemétláda nem cserélné ki a reagenseket, rossz adatok kerülnének a naplóba, és ami történne, az tragédia lenne.
2. Vakkontroll Ct értéke
Ne magyarázd, ha az üres kontrollnak Ct értéke van, az nem környezetszennyezés?Ennek ellenére meg kell értenie, hogy melyik üres vezérlőelemnek van Ct értéke.Ha NTC, az azt jelenti, hogy idegen DNS található, például reagens szennyeződés.Ha NRT, az azt jelenti, hogy a kivont RNS DNS-szennyezett.
3. Standard görbe
A meredekséggel és a számítási képlettel együtt a PCR hatékonysága kiszámítható a képlettel.Egy tökéletes kísérlethez a standard görbe meredeksége megközelíti a 3,32-t, az R² pedig megközelíti a 0,9999-et.
4. Lineáris dinamikatartomány
A reakció dinamikus tartománya lineáris.A standard görbe elkészítéséhez használt sablon szerint a dinamikus tartománynak legalább 5 koncentráció gradienst kell tartalmaznia, és figyelni kell a Ct értékek változására magas koncentráció gradiens és alacsony koncentráció gradiens esetén.
5. Érzékelési pontosság
A qPCR eredmények változását, vagyis a rossz ismételhetőséget, vagyis a rossz precizitást számos tényező okozza, beleértve a hőmérsékletet, a koncentrációt és a működést.A qPCR pontossága általában kevésbé szabályozható, ahogy a másolatszám csökken.Ideális esetben a kísérleten belüli eltérések esetén ennek a technikai eltérésnek meg kell különböznie a biológiai variációtól, és a biológiai ismétlések közvetlenül kezelhetik a csoportok vagy kezelések közötti qPCR-eredmények statisztikai különbségeit.Különösen a diagnosztikai vizsgálatok esetében kell jelenteni a legjobb vizsgálatok közötti pontosságot (ismételhetőséget) a helyszínek és a kezelők között.
6. Érzékelési hatékonyság és LOD (multiplex qPCR-ben)
A LOD a kimutatott pozitív minták 95%-ának legalacsonyabb koncentrációja.Más szavakkal, a célgén-replikátumok sorozatában található LOD koncentrációja nem haladhatja meg a sikertelen reakciók 5%-át.Ha multiplex qPCR-elemzést végez, különösen pontmutációk vagy polimorfizmusok egyidejű kimutatására, a multiplex qPCR-nek bizonyítékot kell szolgáltatnia arra vonatkozóan, hogy több célfragmens pontossága nem sérül ugyanabban a csőben, többszörös detektálás és egycsöves detektálás A hatékonyságnak és a LOD-nak meg kell egyeznie.Különösen akkor, ha a nagy koncentrációjú célgének és az alacsony koncentrációjú célgének egyidejűleg amplifikálódnak, erre a problémára kell figyelni.
Problémák és megoldásokÁltalánosságban elmondható, hogy a qPCR hibakeresés során gyakran előforduló problémák a következő szempontokra összpontosítanak:
·nem specifikus erősítés
· Nehéz kiválasztani a primer koncentrációt és gondok a primer-dimerekkel
· Az izzítási hőmérséklet pontatlan
·A másodlagos szerkezet befolyásolja az erősítési hatékonyságot
nem specifikus erősítés
nem specifikus erősítéselőfordul, általában mérlegelik, hogy az alapozó kialakítása nem megfelelő-e, de ha nem siet az alapozók cseréjével, először megpróbálhatja a következő módszereket (az alapelv is csatolva van):
·Növelje az izzítási hőmérsékletet – próbálja meg a gyenge hidrogénkötéseket ne tudni fenntartani;
·Lerövidíti a lágyítási és nyúlási időt – csökkenti a gyenge hidrogénkötések kialakulásának esélyét;
·Csökkentse a primer koncentrációt – csökkenti a redundáns primerek és a nem célrégiók kötődésének esélyét;
Alacsony erősítési hatásfok
A nem specifikus erősítéssel ellentétes helyzet – alacsony erősítési hatásfok, és az alacsony erősítési hatásfok kezelésére vonatkozó intézkedések éppen az ellenkezője:
· Meghosszabbítja a lágyítási és nyúlási időt;
· Váltson át háromlépcsős PCR-re, és csökkentse a lágyítási hőmérsékletet;
·Növelje a primer koncentrációját;
Ps: Sok 90-es években született végzős hallgató nem hajlandó tanulni a kísérletek hibakeresését, és abban reménykedik, hogy a készlet teljesen megoldja a problémát (ha valaki diploma megszerzése után egy reagenscéghez akar menni kutatni és fejleszteni), sőt, a reagensgyártók is így gondolkodnak, remélem hülyeség. Használható, ha megkapja, így a H reagensgyártók gyenge bevezetésének problémáját is megoldani kell. -kötés abszorpciós tényezői.A probléma egyszerű megoldásához a bolondoknak még mindig el kell olvasniuk a reagensgyártó cég bemutatkozását, hátha van olyan tényező, amely elnyeli a gyenge hidrogénkötéseket.
Nehéz a primer koncentráció kiválasztása és gond a primer-dimerekkel
1. módszer: Általánosságban elmondható, hogy a qPCR-re vonatkozó kit utasítások tartalmazzák az ajánlott rendszereket és az ajánlott primer koncentrációkat.
2. módszer: Hibakeresés a primer koncentráció gradiens beállításával.Az alábbi képet egy cégtől lopták el illusztrációként.Az alábbi ábra a három primer koncentráció gradiens (100 nM, 250 nM, 500 nM) és négy templát koncentráció gradiens (0,1 ng, 1 ng, 10 ng, 100 ng) fluoreszcencia kvantitatív eredményeit mutatja.A kísérleti eredmények Ct értékét a következőképpen ábrázoljuk:

Primer koncentrációjának kiválasztása Kössön össze minden primer koncentrációt egy vonalba az alábbiak szerint:

A primer koncentráció megválasztása kézenfekvő, a 100 nM és 250 nM primer koncentráció lineáris kapcsolata jobb, az 500 nM primer koncentráció lineáris kapcsolata pedig viszonylag rossz.100 nM és 250 nM esetén a 250 nM-os Ct-érték viszonylag kicsi, így az optimális primer koncentráció 250 nM.Az olvadási görbén általában súlyos primer-dimerek láthatók.Mi van akkor, ha a tervezett primerek nem tudják elkerülni a primer-dimereket?
3. módszer: Csökkentse a primerek mennyiségét, és növelje az ellesztési hőmérsékletet (nem kell magyarázni).
Az izzítási hőmérséklet tapasztalati értéke 60°C.Ha nem biztos benne, hogyan válasszon megfelelő izzítási hőmérsékletet?A válasz ugyanaz, mint a primer koncentráció kiválasztásánál –gradiens teszt.Készítsen egy képet a Bio-rad cégtől a probléma illusztrálására.Egy bizonyos célfragmens amplifikálásához állítson be nyolc hőmérsékleti gradienst, mindegyik három ismétléssel, és a kapott amplifikációs görbe a következő:

hőkezelési hőmérséklet kiválasztása:
·70°C, 69°C – Alapvetően a primerek nem kombinálhatók, így nincs amplifikáció.
·67,3°C – Az elején kismértékű erősítés van, a Ct érték pedig viszonylag nagy.
·64,5°C——A Ct érték csökken.
·60,7°C, 58,0°C, 56,2°C és 55,0°C hőmérsékleten a Ct értékek alapvetően stabilak voltak, de a végső fluoreszcencia értékek eltérőek voltak.
Hogyan válasszunk?Alapelv: Az első elv a magasabb Ct érték.Ugyanazon Ct értékhez válasszon magasabb hőkezelési hőmérsékletet, hogy elkerülje a dimerizációt és a nem specifikus amplifikációt.Bár 55°C-on magasabb a fluoreszcencia érték, előfordulhatnak benne dimerek vagy nem specifikus amplifikáció.
De ha Ön olyan okos, mint te, akkor biztosan azt gondolja: Logikusan szólva, ha a PCR reakció nagyon specifikus, amíg a primer koncentrációja meghaladja a minimális követelményt, akkor a magas és a mélypontok nem lehetnek hatással, akárcsak a fluoreszcens festékek és a dNTP-k.Valójában mindaddig, amíg a lágyítási hőmérséklet megfelelően van optimalizálva, a primer koncentrációjának a Ct értékre gyakorolt ​​hatása természetesen minimálisra csökken.

A lágyítási hőmérséklet megfelelően van optimalizálva, és a primer koncentrációjának a CT-re gyakorolt ​​hatása minimális lesz
A másodlagos szerkezet befolyásolja az erősítési hatékonyságot
Vegyük a Bio-rad képét a probléma illusztrálására.Emellett hőmérsékleti gradienst is tervez egy másodlagos szerkezetű gén amplifikálására.

Kialakul a másodlagos struktúra
Látható, hogy a hőmérsékleti gradiens csökkenésével termékek kezdenek megjelenni, és a Ct érték előrehalad, 60,7 °C-on elérve a minimális értéket, majd a hőmérsékleti gradiens csökkenésével a Ct érték nagyobb lesz.Ezzel szemben a hőmérséklet emelkedésével a másodlagos szerkezet kinyílik, és az erősítési hatásfok nő.Egy bizonyos hőmérséklet elérése után a hőmérséklet növelése nem javítja az erősítési hatékonyságot.Mivel az alapozókat jelenleg nem lehet stabilan kombinálni.Ebből adódóan,keresse meg a legalacsonyabb Ct értékű hőmérsékletet, ami a legjobb hőmérséklet a másodlagos szerkezeti sablon erősítésére!Természetesen az okos bolondoknak tudniuk kell, hogy ha nem szükséges, akkor a legjobb a primereket megváltoztatni, és elkerülni a másodlagos szerkezeti régiót.
5. Alkalmazási szint
MIQE – Adatelemzés

Az adatok elemzését elsősorban a fluoreszcens kvantitatív PCR műszer adja.Az előző cikkben sok adatelemző munka történt, például a vakkontroll, amelyet a kísérlet megtervezésekor kifejtettek.Tisztázták a belső referenciagéneket, ismétlésszámokat stb., itt elsősorban a qPCR alkalmazását ismertetjük.
A qPCR-t széles körben használják, és a kísérleti ellenőrzés és a nukleinsav-diagnosztika a leggyakrabban használt forgatókönyv.
abszolút számszerűsítés
A log (kezdeti koncentráció) lineáris kapcsolatban áll a ciklusok számával.Ismert kezdeti kópiaszámú standardból standard görbe rajzolható, azaz megkapható az amplifikációs reakció lineáris összefüggése.A minta Ct értéke alapján a mintában lévő koncentráció kiszámítható.A belefoglalandó sablonok mennyisége.

Abszolút mennyiségi számítási módszer
Az abszolút számszerűsítésnek a standard görbén kell alapulnia.A szabványos görbe elkészítéséhez szabvány szükséges.Általában a standard a célgén klónozásával nyert plazmid.Miért plazmid?Mivel a körkörös plazmid DNS a legstabilabb.A standard terméket 5-6 gradiensben hígítsa a duplázási aránynak megfelelően (10-szeres hígítás), és a hígításnál ügyeljen az egyenletességre.A Ct értéke 15-30 közé essen.

Standard előkészítés
Ugyanakkor a vizsgálandó mintát is ennek megfelelően kell hígítani (ne felejtsük el a hígítási tényezőt), és a Ct érték is 15-30 közé essen.A standard termék + a vizsgálandó minta együtt kerül a gépre.A futtatás után a standard anyaggal standard görbét készítettünk, és a vizsgálandó mintákat a standard görbébe vittük a koncentráció kiszámításához.
A hepatitis B vírus HBV mennyiségi meghatározása egy tipikus abszolút kvantifikáció, amely képes kiszámítani a vírus kópiaszámát 1 ml vérben.
A példányszám kiszámítása
A vizsgálandó minta koncentrációja (ng/ul) = OD260 × 50 ug/ml × hígítási tényező
A minta molekulatömege = bázisok száma × 324
A vizsgálandó minta példányszáma (kópia/ul) = a vizsgálandó minta koncentrációja / a minta molekulatömege × 6 × 1014

A példányszám számítási módja

A fenti a mennyiség meghatározásának számítási módja.Ez egy matematikai probléma, amely a középiskola elvégzése után megoldható, és a matematikai feladatokat általában számítógépek oldják meg.Ha nem érted, jöhetsz kommunikálni.
relatív számszerűsítés
A relatív számszerűsítést főként tudományos kutatásban alkalmazzák.Hány vírus van 1 ml vérben, és ez egy DNS vírus, ez egy viszonylag determinisztikus esemény: a vér mennyisége meghatározható, és a DNS vírus viszonylag stabil.Nehéz azonban összehasonlítani egy bizonyos gén transzkripciós kópiáinak számát egy levélben, mert nehéz meghatározni a levél méretét, súlyát, érzékenységét, nehéz meghatározni a kivont RNS mennyiségét, és a reverz transzkripció hatékonyságát is nehéz meghatározni, vagyis bármely lépésben a kísérleti adatok hibásak lehetnek, és nem használhatók fel.
Ezért a relatív számszerűsítésnek be kell vezetnie egy elemet:a belső referenciagén.
Más szavakkal, a relatív mennyiségi meghatározás valójában a célgén és a belső referenciagén összehasonlítása.Ugyanabban a szövetben és ugyanabban a sejtben összehasonlítva a minta méretének, az RNS-kivonás mennyiségének, a reverz transzkripció hatékonyságának és a PCR hatékonyságának a befolyása viszonylag kicsi.A kis mintaméret miatt mind a belső referenciagének, mind a célgének viszonylag csökkentek.Ezért hangsúlyoztuk korábban is az egységességet és a stabilitást.
A belső referenciagének általábanháztartási gének(háztartási gének), amelyek olyan gének osztályára utalnak, amelyek minden sejtben stabilan expresszálódnak, és termékeik szükségesek a sejtek alapvető élettevékenységének fenntartásához.
Ne keverje össze ezt a fogalmat.A háztartási gének biológiai funkciójú kifejezések, míg a belső referenciagének kísérleti technikai kifejezések.A háztartási géneknek át kell menniük az érvényesítésen, mielőtt kiválaszthatók belső referenciagénként.
Például az alábbi ábrán több háztartási gént választottunk ki, hogy teszteljük expressziós szintjüket különböző szövetsejtekben, és azt találtuk, hogy a β-2-mikroglobulin expressziós szintje egészen más, mint a másik három géné, így nem használhatók belső referenciagénként.

A belső referenciagén korrekciós funkciójának megértése után két algoritmust vezetünk le a belső referenciagén bevezetése miatt.
·kettős standard görbe módszer
·2 – △△Ct módszer (CT-érték összehasonlító módszer)
Ha érdekli a fajok és a génfunkciók tanulmányozása, kérjük, hagyjon fel az algoritmusokkal kapcsolatos kutatással, és használja közvetlenül a képleteket, vagy közvetlenül használjon gépeket;ha egyenes fickó vagy a matematikában és a mérnöki tudományban, akkor nyugodtan.
kettős standard görbe módszer
Számszerűsítse a kontrollminta és a vizsgálandó minta célgénjét és háztartási génjét a standard görbén keresztül, majd számítsa ki a relatív értéket a számítási képlet alapján, amely a relatív expressziós szint.
Előnyök: egyszerű elemzés, viszonylag egyszerű kísérleti optimalizálás
Hátrány: Minden egyes gén esetében minden kísérleti körnek szabványos görbét kell készítenie
Alkalmazás: A génexpresszió szabályozásának vizsgálatában a két leggyakrabban használt és elismert relatív kvantitatív módszer egyike
A képlet a következő:

Példák a következők:

Számítsa ki a relatív mennyiséget a mennyiségi eredmény alapján
2 – △△Ct módszer (CT-érték összehasonlító módszer)

Előnyök: Nem kell szabványos görbét készíteni
Hátrányok: Feltételezzük, hogy az erősítési hatékonyság közel 100%;a szórás < 5%, és a standard görbét és az egyes erősítések közötti hatékonyságot konzisztensnek tekintjük;a kísérleti körülmények optimalizálása bonyolultabb.
Alkalmazás: A génexpresszió szabályozásának vizsgálatában a két leggyakrabban használt és elismert relatív kvantitatív módszer egyike

Természetesen az amplifikációs hatásfok általában lehetetlen, hogy tökéletesen 1 legyen. Korrekciós módszer: Ha tudjuk, hogy a célgén és a referenciagén azonos amplifikációs hatásfokkal rendelkezik, de az amplifikációs hatékonyság nem egyenlő 1-gyel, akkor a 2－△△Ct a következőképpen korrigálható: (1+E )－△△, ha a hatásfok korrigálható amplifikációval, például 0.9. 1,95－△△Ct
Eddig a fluoreszcens kvantitatív PCR-rel kapcsolatos tartalom a végéhez ért.